龔婭軍， 姚衛(wèi)蓉， 謝云飛

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

目前，抗風(fēng)濕類中成藥中美洛昔康的檢測手段單一，主要集中在高效液相色譜以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[1-3]。拉曼光譜是一種指紋圖譜，能提供分子振動和轉(zhuǎn)動的信息，而每一種物質(zhì)在單色強光的照射下都能產(chǎn)生特定的分子振動能和轉(zhuǎn)動能變化，因此每一種物質(zhì)都對應(yīng)一種特定的拉曼光譜，所以被應(yīng)用于物質(zhì)的定性檢測[4]。但常規(guī)的拉曼光譜受到其很弱的拉曼信號的限制，沒能被廣泛應(yīng)用[5]。表面增強拉曼光譜（SERS）可以通過強化基底的物理和化學(xué)增強，極大提高SERS的信號強度，甚至實現(xiàn)單分子檢測[6-7]。SERS以其獨特的優(yōu)勢，例如靈敏度高、操作快速簡便以及可以實現(xiàn)無損檢測等被廣泛應(yīng)用在食品分析[8-9]、生物醫(yī)學(xué)[10-11]以及環(huán)境監(jiān)督中[12-13]。近年來，貴金屬納米粒子修飾的納米陣列作為SERS增強基底引起了研究者們廣泛的興趣，該基底SERS增強效果好，具有良好的重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性。Lin等制備了大面積金納米粒子修飾的硅納米棒，其增強因子達到107，并且發(fā)現(xiàn)長淀粉樣蛋白-β原纖維能在此基底上產(chǎn)生超敏感拉曼信號，這為與阿爾茨海默病相關(guān)的淀粉樣蛋白聚集體的檢測提供了支撐[14]。Lee等利用斜角沉積的方法在硅納米陣列上用金納米粒子修飾，其增強因子達到1.78×106，并且將其應(yīng)用到實際的檢測中，可檢測濃度為0.01~100μmol/L的孔雀石綠[15]。Wei等通過將DNA鏈固定在金納米粒子修飾的硅納米線陣列，用有機染料標(biāo)記的寡核苷酸捕獲和報告探針，可檢測濃度低至10 fmol/L的DNA[16]。

作者通過金屬輔助的化學(xué)刻蝕與無電沉積的方式，制備一種銀納米枝晶修飾的硅納米陣列（silver nanodendrite-modified silicon nanoarrays，AgND/SiNWs），將其作為表面增強拉曼光譜的增強基底應(yīng)用于美洛昔康的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硅片（P-100，單面拋光，5~10Ω·cm，厚度（525±25）μm）：蘇州銳材半導(dǎo)體有限公司產(chǎn)品；美洛昔康對照品（99.99%）：中檢所產(chǎn)品；丙酮（色譜純）、無水乙醇（色譜純）、過氧化氫（分析純）、氫氟酸（分析純）、硝酸（分析純）、乙腈（色譜純）、硝酸銀（基準(zhǔn)）、硝酸鐵（分析純）、硼氫化鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；超純水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司產(chǎn)品；復(fù)方螞蟻活絡(luò)膠囊：四平正和制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

便攜式拉曼光譜儀（RamTracer?-200-HS）：OptoTrace Technologies公司產(chǎn)品；有機濾膜（0.45 μm）：上海安譜公司產(chǎn)品；聚四氟乙烯燒杯：上海申迪玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；聚四氟乙烯坩堝：上海申迪玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；聚四氟乙烯鑷子：蘇州銳材半導(dǎo)體有限公司產(chǎn)品；分析天平（AB104-N）：梅特勒-托利多國際股份有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗儀（KH-500B）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；可調(diào)式移液槍：Dragon-Lab公司產(chǎn)品；SU8100冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡：日本株式會社日立高新技術(shù)公司產(chǎn)品；X射線衍射儀（D2 PHASER）：德國布魯克AXS有限公司產(chǎn)品；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 拉曼檢測條件 掃描功率300 mW，激發(fā)波長785 nm，積分時間5 s，積分次數(shù)3次。

1.3.2 AgND/SiNWs的合成 首先，將P型單面拋光的硅片切割成1.5 cm×1.5 cm的片狀，依次用丙酮、無水乙醇以及超純水超聲清洗10 min，室溫自然晾干。晾干的硅片浸入HF（4.6 mol/L）與AgNO3（0.44 mol/L）溶液中10 s，在其表面形成銀網(wǎng)絡(luò)，銀作為催化劑參與下一步的刻蝕反應(yīng)。后將硅片浸入刻蝕液中進行一定時間的刻蝕，獲得表面有一定深度的陣列，為下一步銀納米粒子的沉積提供極大的比表面積。接著將處理好的硅片浸入HF（4.6 mol/L）與AgNO3（0.01 mol/L））溶液中一定時間，以獲得AgND/SiNWs。最后在體積分?jǐn)?shù)5%的硝酸溶液中浸泡15 min，超純水沖洗表面，取出，室溫晾干，備用。

1.3.3 樣品預(yù)處理 稱取0.3 g樣品，加乙腈30 mL，超聲提取15 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用乙腈稀釋至刻度。過濾，濾液備用；樣品加標(biāo)處理：稱取0.3 g樣品，加乙腈30 mL，加標(biāo)質(zhì)量濃度為2、10、20μg/mL，超聲提取15 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度。過濾，濾液備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洛昔康分子的理論計算與拉曼歸屬指認(rèn)

分別使用HyperChem、Gaussian09對美洛昔康分子進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，然后對最優(yōu)結(jié)構(gòu)進行拉曼位移的理論計算。優(yōu)化時，采用密度泛函方法中的b3lyp方法，并結(jié)合6-311+g（d）基組，分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果如圖1所示；之后將關(guān)鍵字設(shè)為：p opt freq=raman，geom=connectivity，對分子進行拉曼位移的理論計算（校正因子為0.968 0），如圖2所示，與固體美洛昔康的普通拉曼光譜圖對比，光譜圖基本一致。使用GaussianView5.0觀察和分析計算結(jié)果，并使用Veda4進行PED（振動歸屬指認(rèn)）分析，對美洛昔康分子在拉曼光譜中的各個振動峰及其貢獻率進行歸屬指認(rèn)，見表1。

圖1 美洛昔康的分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化圖Fig.1 Optimized molecular structure of meloxicam

圖2中美洛昔康分子的理論計算與固體分子的普通拉曼光譜圖稍有差別但總體基本一致，究其原因，理論計算時考慮的僅僅是單個分子在理想狀態(tài)下的拉曼光譜，而實際樣品中是很多分子聚集在一起的狀態(tài)，因而導(dǎo)致理論計算與實驗光譜有一定的拉曼位移差異，但是絕大多數(shù)的理論計算光譜與實驗光譜具備很好的吻合度，對拉曼特征峰的歸屬以及指認(rèn)具有一定的指導(dǎo)作用。

圖2 美洛昔康的實驗拉曼光譜和理論拉曼光譜Fig.2 Experimental and theoretical Raman spectrum of meloxicam

通過PED分析得出表1并結(jié)合圖1、圖2可以看出，對美洛昔康的拉曼光譜貢獻率最大的特征峰為670、1 032、1 116、1 160、1 264、1 304、1 470、1 530、1 592 cm-1，其中，670 cm-1處為C27—S28以及S28—C27=N32的伸縮振動，主要是S28—C27=N32的伸縮振動，貢獻率為37%；1 032 cm-1處為苯環(huán)內(nèi)C8—C9伸縮振動以及N18—C19的伸縮振動；1 116 cm-1處為S=O的振動；1 160 cm-1處為苯環(huán)內(nèi)C6—C9、H20—C19—N18—S15以 及 H21—C19—N18—S15的振動；1 304 cm-1處為S=O的振動；1 470 cm-1以及1 530 cm-1處為—CH3的伸縮振動；1 592 cm-1處為環(huán)內(nèi)N32=C27以及C29=C30的振動。

表1 美洛昔康理論計算以及實驗拉曼光譜特征峰及振動歸屬表Table 1 Experimental and calculated Raman spectrum in frequency and assignment of meloxicam

2.2 AgND/SiNWs的SERS增強性能

為確定AgND/SiNWs對美洛昔康的SERS增強效果，圖3給出了美洛昔康及其在未刻蝕硅片和AgND/SiNWs上的拉曼光譜。從圖3可以看出，美洛昔康在錫箔紙上經(jīng)普通拉曼檢測沒有任何拉曼信號，光譜中出現(xiàn)的拉曼峰為溶劑乙腈在918、1 374 cm-1處的拉曼位移；在未刻蝕的硅片上同樣觀察不到美洛昔康的拉曼信號，只在520 cm-1處出現(xiàn)單晶硅的拉曼特征峰；而在AgND/SiNWs上觀察到很強的拉曼信號，同樣在520 cm-1處也出現(xiàn)了單晶硅的拉曼信號，證明制備的基底具有很好的SERS增強效果。

圖3 美洛昔康乙腈溶液在錫箔紙上（a）、在未經(jīng)蝕刻的硅片上（b）及AgND/SiNWs上（c）的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra of meloxicam acetonitrile solution in aluminum foil(a)，unetched silicon wafter(b)and AgND/SiNWs(c)

2.3 AgND/SiNWs制備條件優(yōu)化

比較不同氧化劑對硅納米陣列形成過程的影響，從而可改變基底的SERS增強效果。分別使用硝酸鐵（AgND/SiNWs2）、過氧化氫（AgND/SiNWs1）作為氧化劑，與氫氟酸組成2種刻蝕溶液，制備得到2種基底，對美洛昔康的增強效果見圖4（a）。過氧化氫作為氧化劑時制備得到的AgND/SiNWs對美洛昔康的SERS增強性能優(yōu)于硝酸鐵作為氧化劑時制備得到的基底。為進一步證實過氧化氫的主導(dǎo)作用，將過氧化氫與硝酸鐵同時作為氧化劑制備新的基底（AgND/SiNWs3），其對美洛昔康的SERS增強效果與過氧化氫單獨作為氧化劑時一致（見圖4（a））。在整個金屬輔助的化學(xué)刻蝕過程中，根據(jù)原電池模型，涉及一個局域的微電化學(xué)過程[17-18]。簡單表述為：硅片表面形成的Ag網(wǎng)絡(luò)作為催化劑加速底部局域Si的氧化，氫氟酸將氧化后的Si溶解刻蝕后，洗去Ag網(wǎng)絡(luò)層，剩下的Si就形成了SiNWs。Si的氧化可能是形成SiNWs重要的前驅(qū)，而為了加速Si的氧化，必須維持一定濃度的自由Ag+。在HFH2O2-H2O體系中，H2O2不僅作為氧化劑參與其中，并且可以溶解Ag納米顆粒，從而維持溶液中一定濃度的自由Ag+；而在HF-Fe（NO3）3-H2O體系中，有文獻指出[19]，在Fe（NO3）3作為氧化劑參與反應(yīng)時，對于SiNWs的形成起重要作用的是NO3-離子，并非Fe3+離子，這可能是HF-H2O2-H2O體系制備的SiNWs對于美洛昔康的SERS增強效果優(yōu)于HF-Fe（NO3）3-H2O體系的原因。

金屬輔助的化學(xué)刻蝕制備硅納米陣列分為一步法與兩步法。為了探究哪種方法制備的基底對美洛昔康的SERS增強效果更好，采用兩種方法制備AgND/SiNWs，評價其SERS增強效果。結(jié)果如圖4（b）所示。由兩步法制備的基底對美洛昔康的SERS增強效果明顯比一步法好。這是因為在一步法制備基底的過程中，硅片直接浸入由HF/AgNO3/H2O2組成的溶液，而H2O2對Ag顆粒的生長有阻礙作用，加入H2O2后溶液中光激發(fā)的空穴增加，電子減少，所以Ag+無法捕獲更多的e-，進而析出更多的Ag顆粒，使得制備的基底SERS增強效果差于兩步法[20]。

圖4 美洛昔康在不同硅納米陣列的拉曼光譜及硅納米陣列的掃描電鏡圖Fig.4 Raman spectrum of meloxicam in different AgND/SiNWs and the SEM images of different AgNDs/SiNWs

實驗發(fā)現(xiàn)，刻蝕時間對硅納米陣列的形成也有一定影響，從而影響其SERS增強效果。圖4（c）顯示在刻蝕時間為25 min時，基底的SERS增強效果最好，圖4（e）為不同刻蝕時間（10、25、40 min）制備的硅納米陣列截面的掃描電鏡圖?？梢钥闯觯S著刻蝕時間延長，硅納米陣列的長度也隨之增加，與文獻結(jié)果一致。

通過改變鍍銀時間來制備不同的AgNDs/SiNWs，圖4（d）給出了不同鍍銀時間生成的AgNDs/SiNWs對美洛昔康的SERS增強效果圖，鍍銀時間為120 s時，其SERS增強效果最好。鍍銀的過程實際上是一個還原反應(yīng)。初期，相對較高濃度的銀鹽和還原劑導(dǎo)致銀核的生長，在SiNWs的頂部形成微小的AgNPs，隨著反應(yīng)的繼續(xù)，銀鹽和還原劑的濃度都隨之降低，此時銀的生長主要是由表面能的降低驅(qū)動的，從而形成AgNDs。納米級的枝晶縫隙將大大增強拉曼信號強度。當(dāng)反應(yīng)時間延長到180 s，不規(guī)則的AgNDs將影響SERS增強效果[21-23]。圖4（f）為其掃描電鏡圖，可以看出，隨著鍍銀時間由0 s增加至60 s，銀納米枝晶側(cè)面的枝晶也逐漸增多，到120 s時，可以看到銀納米枝晶的分布比較整齊、均勻，當(dāng)時間延長至180 s時，生成的枝晶多而不規(guī)則。

2.4 重現(xiàn)性

以目標(biāo)物美洛昔康為探針分子來探究其重現(xiàn)性，結(jié)果如圖5所示。10次掃描的結(jié)果具有較高的重現(xiàn)性，為了定量評估，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。結(jié)合表2，美洛昔康9個特征峰強度平均RSD為11%。

表2 美洛昔康10次掃描結(jié)果及RSDTable 2 10 scan results and RSD of meloxicam

圖5 美洛昔康在AgNDs/SiNWs上的連續(xù)掃描拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of meloxicam in AgNDs/SiNWs with continuous scanning

2.5 可重復(fù)利用性

以目標(biāo)物美洛昔康為探針分子，探究基底的可重復(fù)利用性。圖6（a）給出了經(jīng)過不同的清洗時間后，基底上殘留的美洛昔康的拉曼光譜圖。可以看出，清洗時間由10 s增加至50 s，仍然可以分辨出美洛昔康在1 592、1 530、1 116、1 032 cm-1等處的位移。當(dāng)清洗時間延長至70 s，基本分辨不出美洛昔康的特征峰。圖6（b）是美洛昔康在清洗70 s、清洗7次的AgNDs/SiNWs上的拉曼光譜圖。隨著清洗次數(shù)的增加，特征峰的強度也逐漸降低，到第7次，美洛昔康的特征峰強度明顯下降，可認(rèn)為該基底清洗時間70 s，可重復(fù)利用7次。

圖6 美洛昔康在AgNDs/SiNWs上的拉曼光譜圖Fig.6 Raman spectra of meloxicam on AgNDs/SiNWs

2.6 儲存穩(wěn)定性

為探究制備的AgNDs/SiNWs基底的時間穩(wěn)定性，以目標(biāo)物美洛昔康為探針分子，放置不同時間后進行拉曼測試，結(jié)果如圖7所示。制備的AgNDs/SiNWs在4 d內(nèi)幾乎保持一致的SERS增強效果，穩(wěn)定性較好，美洛昔康的主要特征峰強度降低幅度很小。在第96天時，仍然能清楚地分辨美洛昔康的主要特征峰。該結(jié)果表明，AgNDs/SiNWs基底時間穩(wěn)定性好，且在距離制備時間越短使用，其SERS增強效果越明顯。放置96 d的AgNDs/SiNWs增強信號有所減弱，但仍可使用。

圖7 AgNDs/SiNWs放置不同時間后對美洛昔康的增強效果對比Fig.7 Comparison of the Raman spectra of meloxicam AgNDs/SiNWs in different time

3 方法應(yīng)用

3.1 目標(biāo)檢測物質(zhì)的確定

將2個質(zhì)量濃度的美洛昔康對照品溶液的拉曼光譜圖與其固體粉末的拉曼光譜圖比較，確定目標(biāo)檢測物質(zhì)。由圖8可以看出，在670、1 032、1 116、1 160、1 264、1 304、1 470、1 530、1 592 cm-1處，兩者拉曼位移一致，可以確定檢測物質(zhì)，并且可將其作為美洛昔康的定性依據(jù)。

圖8 質(zhì)量濃度為25、100μg/mL的美洛昔康對照品溶液與其固體拉曼光譜圖Fig.8 Raman spectra of meloxicam in solid state,25μg/mL and 100μg/mL

3.2 基底與待測液接觸方式對SERS增強效果的影響

待測液與基底的接觸方式對SERS增強效果有影響。作者選取的2種接觸方式為浸泡和滴加。圖9顯示了2種接觸方式對SERS增強效果的影響?？梢钥闯?，浸泡與滴加2種方式的SERS增強效果沒有顯著差別。

圖9 浸泡與滴加兩種接觸方式檢測的美洛昔康拉曼光譜圖Fig.9 Raman spectra of meloxicam detected by two contact methods

3.3 待測溶液滴加體積對SERS增強效果的影響

待測液的體積可影響目標(biāo)分子在AgNDs/SiNWs基底上的吸附情況，從而對SERS增強效果產(chǎn)生影響。圖10顯示了在同一批制備的AgNDs/SiNWs基底上滴加不同體積美洛昔康的拉曼光譜圖?？梢钥闯?，當(dāng)美洛昔康的體積逐漸增加到5μL以后，美洛昔康的主要特征峰峰形及其峰的強度幾乎不再發(fā)生變化。因此，后續(xù)實驗均采用滴加體積5μL的檢測方法。

圖10 不同體積的美洛昔康溶液的拉曼光譜圖Fig.10 Raman spectra of meloxicam solution with different volume

3.4 檢測時間對SERS增強效果的影響

圖11 顯示了美洛昔康在AgNDs/SiNWs基底上進行連續(xù)檢測的拉曼信號強度對比?？梢钥闯觯S著檢測時間的延長，美洛昔康在AgNDs/SiNWs基底上的拉曼特征峰峰形及其強度幾乎保持不變。檢測時間影響SERS增強效果一方面在于其會影響待測分子與基底的結(jié)合強度，而實驗中的溶劑均為乙腈，揮發(fā)性極好，少量的待測液滴加到基底上很快便會揮發(fā)從而只留下待測分子，所以檢測時間對其幾乎不產(chǎn)生影響。

圖11 不同檢測時間下美洛昔康的拉曼光譜圖Fig.11 Raman spectra of meloxicam detected under different adsorption time

3.5 最低檢測濃度以及線性相關(guān)性的確定

圖12 （a）顯示了不同質(zhì)量濃度的美洛昔康在AgNDs/SiNWs上的拉曼光譜圖?？梢钥闯?，隨著美洛昔康的質(zhì)量濃度降低，其主要拉曼特征峰的強度也隨之下降，直到質(zhì)量濃度下降至0.1μg/mL，仍然可以大致分辨其拉曼特征峰，當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)下降至0.05μg/mL時，幾乎觀察不到美洛昔康主要的拉曼特征峰，所以該方法最低檢測質(zhì)量濃度為0.1μg/mL。并且在1 160 cm-1處，拉曼特征峰的強度（即峰的高度）與其質(zhì)量濃度在0.1~25μg/mL呈線性相關(guān)性（y=8.688 7x+89.945 9，R2=0.992 3），線性關(guān)系良好（見圖12（b））。

圖12 不同質(zhì)量濃度的美洛昔康拉曼光譜圖及線性關(guān)系圖Fig.12 Raman spectra and linear diagrams of meloxicam with different mass concentrations

3.6 加標(biāo)回收實驗

為了驗證該方法對實際樣品的檢測效果，對市售的抗風(fēng)濕類中成藥復(fù)方螞蟻活絡(luò)膠囊中的美洛昔康進行檢測，結(jié)果如圖13所示?？瞻讟悠返睦庾V圖中沒有出現(xiàn)美洛昔康的特征峰，說明實驗所用的抗風(fēng)濕類中成藥復(fù)方螞蟻活絡(luò)膠囊中美洛昔康質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于該方法的最低檢測值16.7μg/g；而3個加標(biāo)組（2、10、20μg/mL）的拉曼光譜圖中均出現(xiàn)美洛昔康的拉曼信號，以1 160 cm-1處拉曼強度與美洛昔康質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系為參考，加標(biāo)回收率為80.0%~112.4%，表明該方法具有實用價值。

圖13 美洛昔康固體、空白樣品以及加標(biāo)組的拉曼光譜圖（加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為2、10、20μg/mL）Fig.13 Raman spectra of meloxicam in solid state,blank sample,and liquid state with concentration of 2,10,20μg/mL

4 結(jié) 語

采用金屬輔助的化學(xué)刻蝕原理制備AgNDs/SiNWs，調(diào)節(jié)刻蝕條件，對基底的SERS增強效果進行了研究。具體內(nèi)容如下：通過改變刻蝕液種類、刻蝕方法、刻蝕時間以及鍍銀時間，制備出SERS增強效果更好的AgNDs/SiNWs。具體選擇HF-H2O2-H2O體系作為刻蝕液，采用兩步法，刻蝕時間25 min，鍍銀時間120 s的刻蝕條件。優(yōu)化采用該基底檢測美洛昔康的檢測條件，將5μL美洛昔康滴加在AgNDs/SiNWs上進行拉曼檢測，最低檢測質(zhì)量濃度為0.1μg/mL。對市售抗風(fēng)濕類中成藥復(fù)方螞蟻活絡(luò)膠囊中的美洛昔康進行檢測，并計算加標(biāo)回收率。實際樣品中美洛昔康質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于該方法最低檢測值16.7μg/g，且加標(biāo)回收率為80.0%~112.4%。該方法操作簡單快速，對實驗儀器設(shè)備要求低，為有關(guān)部門對抗風(fēng)濕類中成藥中的違法添加物質(zhì)美洛昔康的檢測提供一種新方法。