邱 玲， 陳 晟， 吳 敬， 黃 燕

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

γ-氨基丁酸（GABA）是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，是由谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）不可逆、專一地將L-谷氨酸的α-羧基脫去一分子CO2得到，是高度溶于水的兩性離子，pK值為4.03和10.56[1]，因此表現(xiàn)出與該類氨基酸類似的生理活性，即作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[2-3]。目前廣泛應(yīng)用于工業(yè)、動物飼料、醫(yī)藥和食品行業(yè)[4-5]。

大量研究表明，GABA有促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶力、抗焦慮、預(yù)防和治療癲癇、延緩腦衰老、舒緩血管、調(diào)節(jié)激素分泌、提高受精率、解除氨毒、增強(qiáng)肝功能等作用[6-11]。

目前制備GABA的方法主要有植物富集法、化學(xué)合成法[12-13]、微生物發(fā)酵法[14-15]、酶催化法[16]。 植物富集法生產(chǎn)GABA雖然安全環(huán)保，但GABA濃度低，尚無法用作藥物、食品添加劑；化學(xué)合成法生產(chǎn)GABA安全性較差、有化學(xué)殘留，也不易達(dá)到醫(yī)藥及食品行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)；微生物發(fā)酵法得到的GABA是一個多相復(fù)雜體系，濃度低，下游產(chǎn)物分離成本高，是生產(chǎn)高純度、高濃度GABA的一個瓶頸問題。所以，目前制備GABA多采用酶催化法，主要是利用微生物細(xì)胞內(nèi)分離得到的谷氨酸脫羧酶或能夠生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細(xì)胞專一、不可逆地脫去L-谷氨酸的α-羧基，從而得到高濃度、高純度的GABA。此方法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和、不需要昂貴的原料、能耗低，并且微生物來源的谷氨酸脫羧酶和能夠生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的微生物細(xì)胞可通過簡單的細(xì)胞培養(yǎng)大量獲取[17]。

目前大多研究以大腸桿菌為宿主表達(dá)GAD，催化生產(chǎn)GABA。在重組菌發(fā)酵過程中添加一定濃度的輔酶磷酸吡哆醛（PLP）能夠促進(jìn)GAD的折疊，從而提高GAD酶活力[18-19]。除此之外，酶催化法即利用GAD將谷氨酸脫去一分子CO2制備GABA過程中，在酶轉(zhuǎn)化體系中添加一定量的PLP可以促進(jìn)酶液或全細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[17]。有研究者[16]報道了在大腸桿菌發(fā)酵過程中直接添加0.02 mmol/L PLP后，GABA產(chǎn)量是對照的2.0~2.5倍。但是PLP價格昂貴，在發(fā)酵過程和酶轉(zhuǎn)化體系中直接添加無疑大大增加生產(chǎn)成本。由于大腸桿菌自身具備吡哆醛激酶（PdxK）基因和磷酸吡哆醇氧化酶（PdxH）基因，從而形成PLP補(bǔ)救途徑（見圖1）。輔酶前體吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）和吡哆醛（PL）上5′羥甲基通過PdxK使其磷酸化，生成對應(yīng)的輔酶中間體磷酸吡哆醇（PNP）和磷酸吡哆胺（PMP）以及輔酶磷酸吡哆醛（PLP），PdxH進(jìn)一步催化PNP或PMP的氧化反應(yīng)，生成輔酶PLP[20-25]，輔酶PLP的增加可促進(jìn)GAD的折疊，提高GAD酶活力。黃燕等[18]研究了在大腸桿菌發(fā)酵過程中添加PN后，酶活是對照組（不添加PN）的1.8倍。

圖1 大腸桿菌中PLP的補(bǔ)救途徑[25]Fig.1 Salvage pathway of PLPin E.coli

但是大腸桿菌為非食品安全菌株，在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生內(nèi)毒素，并且需要添加價格昂貴且有毒害作用的IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)酶，其生產(chǎn)得到的GAD安全性不高，距離滿足食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的要求還有一定差距。枯草芽孢桿菌是通過美國食品和藥物管理局GARS認(rèn)證的安全菌株，廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥生產(chǎn)中。然而在枯草芽孢桿菌中缺少PdxH，所以無法利用添加輔酶前體PN的方式，通過PLP補(bǔ)救途徑將PN轉(zhuǎn)化為PLP，從而提高GAD酶活力[27-29]。目前，大量的研究集中在以枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)GAD，在酶轉(zhuǎn)化過程中通過直接添加輔酶PLP提高轉(zhuǎn)化效率，如丁偉等[26]運(yùn)用安全宿主枯草芽孢桿菌生產(chǎn)GABA，在其轉(zhuǎn)化過程中直接添加PLP，全細(xì)胞催化GABA產(chǎn)量為239.91 g/L，轉(zhuǎn)化率54.48%。由于PLP價格昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，無法適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求。關(guān)于在枯草芽孢桿菌為宿主生產(chǎn)GAD發(fā)酵過程中，添加價格低廉的輔酶前體以提高GAD酶活力的研究未見報道。因此作者以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為宿主，通過基因工程將大腸桿菌來源的谷氨酸脫羧酶基因（gadB）在B.subtilis中異源表達(dá)，添加相對廉價的輔酶前體PL，通過PdxK介導(dǎo)的PLP補(bǔ)救途徑將其轉(zhuǎn)化生成PLP（見圖2），從而提高酶活和產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

圖2 PdxK激酶催化PL生成PLP[27]Fig.2 PdxK kinase catalyzes PL to PLP

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 質(zhì)粒E.coli JM109/pET-24a（+）-gadB為作者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，菌株B.subtilis和表達(dá)載體pHY300PLK（含啟動子PHpaII和PamyQ，不含信號肽）由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L）：分別稱取氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g，溶于1 L去離子水中，并通過添加2 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。

LB固體瓊脂培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂粉。

高滲液體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加0.5 mol/L山梨醇。

電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中分別添加0.5 mol/L山梨醇和甘露醇，質(zhì)量濃度為100 g/L的葡萄糖。

RM培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加0.5 mol/L山梨醇和0.38 mol/L甘露醇。

TB培養(yǎng)基（g/L）：分別稱取酵母粉24 g、蛋白胨12 g、甘油5 g、三水磷酸氫二鉀16.43 g、磷酸二氫鉀2.31 g，溶于1 L去離子水中，并添加2 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.1.3 試劑 Quickcut Hin d III限制性內(nèi)切酶：購自TaKaRa生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；2×phanta Max Master Mix、Exnase II無縫連接試劑盒：購自諾唯贊（南京）生物科技有限公司；DL-10000DNA Marker、氨芐青霉素、四環(huán)素：購自寶生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司；Unstained Protein MW Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白品、蛋白膠制備試劑盒：購自碧云天生物技術(shù)有限公司；分子級的蛋白胨和酵母粉：購自英國Oxiod公司；其他常規(guī)試劑：購自國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器 PCR儀：購自美國Bio-Rad公司；722型紫外可見分光光度計(jì)：購自上海儀電分析儀器有限公司；冷凍式離心機(jī)：購自Beckman coulter公司；KQ-250E型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：購自寧波新芝生物科技股份有限公司；pH計(jì)：購自瑞士Mettler-Toledo公司；高效液相色譜儀：購自安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 以質(zhì)粒pET-24a（+）-gadB為模板，根據(jù)無縫克隆同源臂設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)正、反向引物：

正向引物（F1）：5′-GGAGTGTCAAGAATGGAC CAGAAGCTGTTAACGGA-3′；反向引物（R1）：5′-TTTATTACCAAGCTTTCAGGTGTGTTTAAAGCTGT TC-3′。

以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，根據(jù)無縫克隆同源臂設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)正、反向引物：

正向引物（F2）：5′-TCAAATAAGGAGTGTCAA GAATG-3′；反向引物（R2）：5′-GGTGTTTTTTTATT ACCAAGCTT-3′。

將設(shè)計(jì)好的引物送至蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 目的基因和表達(dá)載體的獲取 以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET-24a（+）-gadB為模板，F(xiàn)1/R1為正反向引物擴(kuò)增gadB目的基因；PCR反應(yīng)體系（50μL）：5×PSBuffer 10μL、ddH2O 34μL、dNTP 4μL、模板DNA 0.5μL，正、反向引物各0.5μL，Primer STAR Polymerase 0.5μL。

PCR程序：94℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸2 min，變性至延伸過程進(jìn)行29個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，F(xiàn)2/R2為正反向引物擴(kuò)增表達(dá)載體；PCR反應(yīng)體系（50μL）：5×PS Buffer 10μL、ddH2O 34μL、dNTP 4μL、模板DNA 0.5μL，正、反向引物各0.5μL，Primer STARPolymerase 0.5μL。

PCR程序：94℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸6 min，變性至延伸過程進(jìn)行29個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

目的基因和表達(dá)載體PCR條帶通過瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 目的基因和表達(dá)載體的連接與鑒定 將1.2.2 已驗(yàn)證正確的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。回收后的PCR產(chǎn)物用Exnase II連接酶連接，其連接體系如下：ddH2O 5.3μL、5×CE Buffer 2μL、Exnase II 1μL、表達(dá)載體1.16μL、目的基因0.54μL，置于PCR儀37℃反應(yīng)30 min完成連接。

采用大腸桿菌JM109熱擊轉(zhuǎn)化法后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂布至含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10~12 h，挑取單菌落至含100μg/mL氨芐青霉素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37℃、200 r/min培養(yǎng)8~10 h后收集菌體，并提取質(zhì)粒以便驗(yàn)證和進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行Hin d III酶切驗(yàn)證正確后送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將測序正確的質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入表達(dá)宿主B.subtilis中，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂布至含20μg/mL四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)10~12 h，挑取單菌落至含20μg/mL四環(huán)素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床37℃、200 r/min培養(yǎng)8~10 h后收集菌體，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GAD及蛋白質(zhì)檢測 將－80℃保存的重組菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB以體積分?jǐn)?shù)0.2%接種至含20μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床37℃、200 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)8~10 h，再以體積分?jǐn)?shù)5%轉(zhuǎn)接至含20μg/mL四環(huán)素的TB發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床37℃、200 r/min培養(yǎng)2~3 h后分別加入一定濃度的PLP、PL、PN，于恒溫?fù)u床33℃、200 r/min進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。發(fā)酵過程中在不同時間取樣，測OD600。12 000 r/min離心1 min得到菌體和發(fā)酵上清液。將菌體用1 mL、50 mmol/L、pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液重懸，加入0.6 mg/mL溶菌酶，在37℃反應(yīng)30 min后置于冰水中超聲破碎，12 000 r/min離心5 min得到破壁上清液和破壁沉淀，使用SDS-PAGE檢測其蛋白質(zhì)。

1.2.5 重組GAD酶活測定 底物溶液配制：0.1 mol/L一水谷氨酸鈉和0.15 mmol/L PLP溶于50 mmol/L、pH 4.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，置于4℃避光保存。

反應(yīng)體系：將裝有360μL底物溶液的1.5 mL EP管于37℃水浴鍋預(yù)熱10 min后，加入40μL GAD粗酶液，在37℃下反應(yīng)4 min后，加入600μL、0.2 mol/L、pH 10的硼酸緩沖液終止反應(yīng)，置于沸水中滅活10 min。

GABA生成量測定：采用HPLC-OPA氨基酸柱前衍生法檢測GABA生成量[30]。

酶活定義：在反應(yīng)液中，1 min催化底物轉(zhuǎn)化生成1μmol GABA所需的酶量為一個活力單位（U）。

本文中重組GAD均指重組菌所產(chǎn)的GAD。

1.2.6 重組菌全細(xì)胞制備GABA工藝流程

1）GABA的制備 用水配制質(zhì)量濃度為127 g/L的一水谷氨酸鈉底物（折算成100 g/L谷氨酸，以下均以折算后的谷氨酸質(zhì)量濃度進(jìn)行闡述）。在150 mL三角錐形瓶中加入20 mL底物，加入一定量的濕菌體（在55℃水浴鍋預(yù)處理50 min，改善細(xì)胞膜的通透性），反應(yīng)過程中，每隔2 h用0.6 mol/L的H2SO4和NaOH調(diào)節(jié)pH，使其始終與初始pH一致。在一定溫度、pH下，150 r/min水浴搖床中反應(yīng)一段時間，終止反應(yīng)后進(jìn)行煮沸處理，12 000 r/min離心5 min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。

2）GABA生成量的測定 將過濾好的樣品通過HPLC檢測GABA生成量[30-31]。HPLC色譜條件如下：Agilent 1200 HPLC色譜儀、Agilent自動進(jìn)樣器、GL Inertsil ODS-3液相柱、Agilent紫外檢測器。流動相A：準(zhǔn)確量取995 mL純凈水，加入4.52 g無水乙酸鈉，攪拌使其充分溶解，再加入5 mL四氫呋喃和0.2mL三乙胺，之后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.20±0.05，充分混合后用0.22μm無機(jī)纖維素濾膜過濾備用；流動相B：準(zhǔn)確量取200 mL純凈水，加入4.52 g無水乙酸鈉，攪拌使其充分溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.20±0.05后，再依次加入400 mL色譜純的乙腈和甲醇，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至7.20±0.05，混合后用0.22μm有機(jī)尼龍濾膜過濾備用。梯度洗脫，流量為0.8 mL/min，柱溫為40℃。根據(jù)吸收峰面積和GABA標(biāo)準(zhǔn)品峰面積計(jì)算GABA生成量，計(jì)算公式如下：

式中：Y為GABA轉(zhuǎn)化率，%；A為谷氨酸轉(zhuǎn)化生成GABA的實(shí)際質(zhì)量濃度，g/L；T為谷氨酸轉(zhuǎn)化生成GABA的理論質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)谷氨酸脫羧酶重組菌的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET-24a（+）-gadB為模板，擴(kuò)增gadB目的片段，并以質(zhì)粒載體pHY300PLK為模板，擴(kuò)增表達(dá)載體片段。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因片段gadB和質(zhì)粒表達(dá)載體pHY300PLK長度約為1 428 bp和5 731 bp，與理論堿基大小一致。驗(yàn)證正確后通過Exnase II連接酶將兩個基因片段連接再轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布到LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素抗性）后挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素抗性）中過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證和測序成功后，將重組質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入表達(dá)宿主B.subtilis并涂布到LB固體培養(yǎng)基（含四環(huán)素抗性），之后挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基（含四環(huán)素抗性）中培養(yǎng)8~10 h，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證分析。結(jié)果見圖3，分別在5 130 bp和2 100 bp處有明顯的條帶，說明重組表達(dá)質(zhì)粒pHY300PLKgadB在B.subtilis中構(gòu)建成功。

圖3 酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pHY300PLK-gadBFig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid pHY300PLK-gadB

2.2 分別添加輔酶及輔酶前體對重組菌搖瓶發(fā)酵的影響

2.2.1 添加不同種類輔酶及輔酶前體對重組菌產(chǎn)酶情況的影響 重組菌按照1.2.4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，搖瓶發(fā)酵溫度33℃，在重組菌發(fā)酵過程中分別添加輔酶PLP（簡稱GAD-PLP）、輔酶前體PL（簡稱GAD-PL）和PN（簡稱GAD-PN）至終濃度為0.5 mmol/L。發(fā)酵結(jié)束后12 000 r/min離心1 min獲得菌體，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，12 000 r/min離心5 min得到GAD粗酶液。結(jié)果見圖4，誘導(dǎo)48 h后，酶活分別達(dá)到25.40、28.14 U/mL和15.55 U/mL，是對照GAD-0酶活（16.34 U/mL）的1.55、1.72和0.95倍。由此可知，添加0.5 mmol/L PN時，酶活相較于對照并無明顯區(qū)別，這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌中缺少PdxH氧化酶，無法通過PLP補(bǔ)救途徑將PN轉(zhuǎn)化為PLP，從而提高GAD酶活力。其次隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞內(nèi)合成的少量PLP被自身吸收并消耗而無法滿足GAD表達(dá)水平提高的需要。然而向培養(yǎng)基中添加適量的PLP或PL可以直接或間接通過PLP補(bǔ)救途徑合成PLP，從而提供能夠維持GAD穩(wěn)定的輔酶PLP，促進(jìn)GAD的折疊，提高酶活[19]。鑒于PLP成本高于PL，所以在發(fā)酵過程中選擇添加PL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同培養(yǎng)基添加劑濃度對重組GAD表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different medium additives on the production of the recombinant GAD

2.2.2 不同吡哆醛濃度對重組菌產(chǎn)酶情況的影響重組菌按照1.2.4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在過程中添加不同濃度的PL（0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.2、0.3 mmol/L）發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，12 000 r/min離心1 min獲得菌體，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，12 000 r/min離心5 min得到GAD粗酶液，結(jié)果見圖5。隨著PL濃度的增加，GAD酶活也隨之提高，當(dāng)PL濃度為0.1 mmol/L時，GAD酶活達(dá)到最高為28.28 U/mL。繼續(xù)增加PL的濃度，酶活并未發(fā)生顯著變化，故可知PL的最適添加濃度為0.1 mmol/L。圖6為發(fā)酵過程中添加不同濃度PL后的重組GAD蛋白質(zhì)電泳圖，從圖中可見在相對分子質(zhì)量53 000的條帶附近有一條清晰的蛋白質(zhì)電泳條帶，符合GAD理論蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小。

圖5 不同PL濃度對重組GAD酶活的影響Fig.5 Effects of different concentration of PL on the enzyme activity of the recombinant GAD

圖6 不同PL濃度對重組GAD表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different concentration of PL on the production of the recombinant GAD

2.2.3 添加吡哆醛前后重組菌發(fā)酵過程比較 重組菌按照1.2.4進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在過程中添加0.1 mmol/L PL，探究其在不同發(fā)酵時間（0、12、24、36、48、60 h）對重組菌生長（見圖7）和產(chǎn)GAD情況（見圖8）的影響。與GAD-0相比，在發(fā)酵時間36 h左右，PL對菌體的生長有一定的促進(jìn)作用，是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)表達(dá)過程中，通過PLP補(bǔ)救途徑，PdxK激酶將PL磷酸化形成PLP[24]，促進(jìn)GAD的折疊，一定程度上有利于菌體生長。隨著發(fā)酵時間的延長，由于PLP穩(wěn)定性差而失去作用，導(dǎo)致菌體的生長有所下降。由圖8可知，與GAD-0相比，GAD-PL酶活最高達(dá)到28.28 U/mL，添加適量的PL可以提供給GAD未知濃度的PLP，從而提高GAD酶活。

2.3 重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備GABA的工藝優(yōu)化

2.3.1 溫度對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響 酶法制備GABA是一個不可逆反應(yīng)，適宜的溫度可以使GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，所以通過設(shè)置不同的酶轉(zhuǎn)化溫度來探究溫度對GABA轉(zhuǎn)化率的影響。以100 g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入濕菌體（在55℃水浴鍋預(yù)處理50 min，改善細(xì)胞膜的通透性）30 U/g，在150 r/min的水浴搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0。溫度梯度設(shè)置為25、30、35、40、45、50℃，反應(yīng)24 h后終止反應(yīng)并進(jìn)行煮沸處理，12 000 r/min離心5 min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖9。轉(zhuǎn)化率隨溫度升高逐漸提高，當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度達(dá)到40℃時，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，分別為64.78%和82.27%，繼續(xù)升高溫度，轉(zhuǎn)化率反而降低。這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌細(xì)胞壁厚，而反應(yīng)溫度過低時，底物與胞內(nèi)酶液無法充分接觸使得轉(zhuǎn)化率低；當(dāng)反應(yīng)溫度過高時，酶與PLP穩(wěn)定性差，從而影響GABA的轉(zhuǎn)化率。

2.3.2 pH對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響以100 g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的濕菌體30 U/g，在40℃、150 r/min的水浴搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程中，每隔2 h用0.6 mol/L的H2SO4或NaOH調(diào)節(jié)pH，使其始終與初始pH保持一致。pH梯度設(shè)置為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反應(yīng)24 h后終止反應(yīng)并進(jìn)行煮沸處理，12 000 r/min離心5 min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖10，當(dāng)pH為4.5或5.0時，GABA轉(zhuǎn)化率最高，GAD-0的GABA轉(zhuǎn)化率為75.45%和76.21%，GAD-PL的GABA轉(zhuǎn)化率為84.54%和84.21%。當(dāng)pH小于4.5時，底物一水谷氨酸鈉在酸性條件下容易酸水解生成谷氨酸析出，從而形成乳白色渾濁液體，不利于酶與底物的充分結(jié)合；當(dāng)pH大于5.0時不利于酶活性中心的賴氨酸殘基以shifft-堿與PLP、底物結(jié)合，從而抑制GABA的生成?？梢姡皋D(zhuǎn)化法制備GABA的pH耐受范圍窄，過酸或過堿都不利于酶促反應(yīng)進(jìn)行，考慮在高質(zhì)量濃度底物下，過低的pH更容易導(dǎo)致底物析出，所以酶轉(zhuǎn)化最適pH為5.0。

圖10 反應(yīng)p H對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.10 Effect of pH on enzymatic conversion

2.3.3 加菌量對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響 以100 g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的不同濕菌體（20、30、40、50、60 U/g），在40℃、150 r/min的水浴搖床中反應(yīng)24 h，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行煮沸處理，12 000 r/min離心5 min得上清液，適當(dāng)稀釋后用氨基酸柱前衍生法進(jìn)行HPLC檢測。結(jié)果見圖11，重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化率隨著加菌量的增加而逐漸提高，其中GAD-PL和GAD-0分別在40 U/g和50 U/g時將底物完全轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因?yàn)榍罢呒?xì)胞中的PLP含量高于后者，PLP作為輔助因子有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

圖11 不同加菌量對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.11 Effect of wet cell dosage on enzymatic conversion

2.3.4 反應(yīng)時間對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響 以100 g/L的谷氨酸為底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL加入量分別為50 U/g和40 U/g，在40℃、150 r/min的水浴搖床中反應(yīng)24 h，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行煮沸處理，12 000 r/min離心5 min得上清液，適當(dāng)稀釋后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖12。在0~20 h，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)化合成GABA的產(chǎn)量隨時間延長迅速增加，在20 h時轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，之后隨著反應(yīng)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率不再發(fā)生變化。

圖12 反應(yīng)時間對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.12 Effect of reaction time on enzymatic conversion

2.3.5 底物質(zhì)量濃度對重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的影響 以200 g/L的谷氨酸為初始底物，溶于去離子水中，加入預(yù)處理過的不同濕菌體，GAD-0和GAD-PL加菌量分別為50 U/g和40 U/g，在40℃、150 r/min的水浴搖床中反應(yīng)6 h后，每隔3 h補(bǔ)加1.27 g的谷氨酸固體至底物質(zhì)量濃度分別為200、250、300、350、400 g/L，反應(yīng)過程中，控制pH為5.0，反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行煮沸處理，12 000 r/min離心5 min得上清液，適當(dāng)稀釋并過0.22μm有機(jī)濾膜后用HPLC-OPA柱前衍生法進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖13，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到400 g/L谷氨酸時，GAD-0和GAD-PL轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的轉(zhuǎn)化率分別從100%（底物質(zhì)量濃度350 g/L谷氨酸）下降為97.72%和98.43%。綜合考慮，為提高工業(yè)生產(chǎn)效率和節(jié)省下游分離純化成本，選擇350 g/L作為酶法制備GABA的最適底物質(zhì)量濃度。

圖13 不同底物質(zhì)量濃度對酶轉(zhuǎn)化的影響Fig.13 Effect substrate concentration on enzymatic conversion

3 結(jié)語

作者成功構(gòu)建并重組表達(dá)了含有Escherichia coli來源的 gadB基因的重組菌 B.subtilis/pHY300PLK-gadB。實(shí)驗(yàn)表明在發(fā)酵過程中添加0.5 mmol/L輔酶前體PL的GAD總酶活達(dá)到28.14 U/mL，是對照總酶活的1.72倍。進(jìn)一步優(yōu)化重組菌全細(xì)胞酶法生產(chǎn)GABA的工藝條件，結(jié)果表明，當(dāng)溫度為40℃，pH為5.0，GAD-0和GAD-PL的最適加菌量分別為50 U/g和40 U/g時，GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。當(dāng)谷氨酸質(zhì)量濃度為400 g/L時，GABA產(chǎn)量分別為275.60 g/L和273.61 g/L。綜上所述，作者考察了菌體發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加輔酶前體PL對重組菌產(chǎn)GAD及制備GABA的影響，開發(fā)了一種不需要在發(fā)酵過程和酶轉(zhuǎn)化體系中添加昂貴輔酶PLP就能高效生產(chǎn)GABA的工藝技術(shù)，為GABA在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。