唐語謙， 劉晨迪， 潘藥銀， 楊繼國*

（1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808）

嘔吐毒素因其可導(dǎo)致豬嘔吐拒食而獲名，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，近年在全球谷物、糧食制品及飼料中出現(xiàn)頻率最高，具有細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性等[1]，嚴(yán)重威脅人和動(dòng)物的健康，已成為食品安全的首要衡量指標(biāo)。DON主要存在于染赤霉病的小麥中，而赤霉病在全國各地的作物中頻發(fā)，因此DON檢出率居高不下。2016年，赤霉病害流行，河南西華和江蘇建湖的發(fā)病小麥分別達(dá)100%和69.96%[2-3]。2017年，國內(nèi)各地區(qū)玉米副產(chǎn)物和全價(jià)料中DON檢出率高達(dá)100%，小麥及麩皮和玉米副產(chǎn)物中DON超標(biāo)率分別為10.67%和6.67%[4]。2018上半年，小麥赤霉病全國見病面積達(dá)37.5%[5]，原料及飼料中DON檢出率達(dá)100%[6-7]。隨著科技的發(fā)展和人類對于食品安全的日趨重視，如何高效安全地去除DON，從而解決污染問題成為研究的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法雖然都可以在一定程度上去除DON，但是存在能耗高、安全性低和破壞谷物營養(yǎng)特性等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足糧食生產(chǎn)與加工的需要。而生物降解法因其具有毒性低、污染小、速度快、特異性強(qiáng)、安全性高、殘留少或無殘留及對飼料營養(yǎng)物質(zhì)無損傷等優(yōu)點(diǎn)更受研究者的青睞。DON雖然可于1 h內(nèi)，在250℃下被完全降解，但是該溫度用于降解糧食中的毒素不切實(shí)際[8]。輻照和臭氧處理也可降解DON，飽和臭氧水10 min內(nèi)對小麥中DON的降解率達(dá)74.86%[9]，但其降解效率對載體的依賴程度較高且安全性存疑。馮敏等采用5 kGy的60Co-γ射線輻照散裝大米（DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)為112.5μg/kg），降解率僅為38.4%[10]。

DON的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，環(huán)氧基團(tuán)、C3位羥基和C16位甲基是其主要的毒性結(jié)構(gòu)。通過改變DON分子結(jié)構(gòu)，例如C12、C13位脫環(huán)氧化，C3位羥基的乙?；?、異構(gòu)化、糖基化以及氧化和C16位羥基化等[11]，可生成不同類型的DON衍生物，進(jìn)而減弱或去除毒性[12]。DON的C3位羥基乙?；?、異構(gòu)化、糖基化分別生成3-keto-DON、3-epi-DON（幾乎無毒）和DON3G，與DON相比毒性均較低，但口服DON3G后水解為DON可能導(dǎo)致總毒性增強(qiáng)[13]。另外部分基團(tuán)的轉(zhuǎn)化反而導(dǎo)致毒性升高，它們的體外毒性排序?yàn)?5ADON≥DON>3ADON>DOM-1[14]。環(huán)氧基團(tuán)通過與核糖體連接影響蛋白質(zhì)合成[15]，DON脫環(huán)氧化形成的DOM-1無細(xì)胞毒性。

由此可見，DON的降解脫毒是一個(gè)復(fù)雜過程，僅靠一個(gè)或一種酶難以完成，徹底脫毒仍需多種酶共同作用。目前國內(nèi)外關(guān)于DON降解酶基因的文獻(xiàn)報(bào)道很少，開發(fā)降解酶投入市場，還需要對其進(jìn)行分離純化，并對酶的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步研究酶學(xué)性質(zhì)以及效應(yīng)物對酶活性的影響等[16]，單個(gè)酶的應(yīng)用仍道阻且長。因此，目前直接利用微生物降解DON更具可行性。作者從各類可降解DON的微生物入手進(jìn)行歸納總結(jié)，重點(diǎn)分析比較了其轉(zhuǎn)化方式和產(chǎn)物毒性，以期為將來單個(gè)或混合菌種、單個(gè)酶或多個(gè)酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外對于生物降解DON的研究有了一定進(jìn)展，但是與分離出來的單菌株種類相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道不多，主要為細(xì)菌，有芽孢桿菌屬、德沃斯氏菌屬、諾卡氏菌屬等（見表1）。關(guān)于DON降解酶的分離提純及其基因外源表達(dá)的研究報(bào)道更是少之又少。

1 細(xì)菌的降解

1.1 芽孢桿菌屬（Bacillus）

芽孢桿菌是一類可產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，對外界不良因素的抵抗力強(qiáng)，分布較廣，具有增殖快、抗逆性強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)。研究者已從霉變秸稈[17]、土壤[18]、被污染的玉米[19]或食用霉菌污染飼料的母雞糞便[20]中，篩選到蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌等，均可在72 h內(nèi)降解飼料中質(zhì)量分?jǐn)?shù)73.50%~98.85%的DON，實(shí)現(xiàn)高效降解，但是其代謝產(chǎn)物及毒性都未得到驗(yàn)證。其中，馬秋剛發(fā)現(xiàn)的枯草芽孢桿菌ANSB471傳代能力穩(wěn)定，能分泌高活力的淀粉酶，提高動(dòng)物對飼料的利用率[21]；郭倩倩篩選的地衣芽孢桿菌YB9不僅具有耐鹽耐高溫、抗逆性較好的優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可減弱DON對動(dòng)物的毒性[18]；有研究報(bào)道了環(huán)狀芽孢桿菌對熱的穩(wěn)定性以及對pH的耐受性強(qiáng)[20]。

此外，芽孢桿菌作為益生菌中常見的菌屬，在禽畜業(yè)發(fā)揮著重要作用。不僅可以促進(jìn)免疫器官生長發(fā)育，增強(qiáng)非特異性和特異性免疫，而且可促進(jìn)紅細(xì)胞免疫，從而提高動(dòng)物的免疫功能[22]。芽孢桿菌還具有產(chǎn)腈水合酶的潛能。從農(nóng)田土壤中分離得到阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）Jn-102，所產(chǎn)酶對芳香腈有較好的水合作用，可用于制備酰胺化合物[23]。此外，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌可產(chǎn)堿性蛋白酶，在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵。該酶在制藥、食品、洗滌劑等工業(yè)中被廣泛應(yīng)用，并且國內(nèi)相關(guān)研究已達(dá)到分子水平[24]。

1.2 德沃斯氏菌屬（Devosia）

德沃斯氏菌為需氧型革蘭氏陰性菌，不產(chǎn)芽孢。不同于對芽孢桿菌的研究僅停留在DON降解效率上，德沃斯氏菌的降解機(jī)制（見圖1）研究得更為深入和透徹。目前大部分菌株分離自土壤或受鐮刀菌感染的植物，可將DON的C3位羥基氧化或異構(gòu)化，其降解酶及基因也已明確。這些菌株均可在48 h內(nèi)降解液體培養(yǎng)基中質(zhì)量分?jǐn)?shù)88%以上的DON[25-28]，其中DDS-1[25]和ANSB714[26]在飼料中的降解率分別為75.47%和86.19%。

圖1 德沃斯氏菌的降解途徑Fig.1 Degradation pathway of Devosia

這些菌株的生物降解產(chǎn)物和機(jī)理相似。除德沃斯氏菌17-2-E-8可產(chǎn)生3-epi-DON外[27]，其余3種菌株的最終產(chǎn)物都為3-keto-DON[25-26，28]。研究表明，德沃斯氏菌17-2-E-8先將DON氧化成毒性較低的3-keto-DON，再將其還原成3-epi-DON。有研究者[29-30]從該菌中克隆了參與降解反應(yīng)的基因DepA和DepB。這兩個(gè)基因分別屬于乙醇脫氫酶和醛酮還原酶超家族，都需要輔酶參與才能完成催化反應(yīng)。德沃斯氏菌17-2-E-8的DepB是第一個(gè)被克隆的參與DON C3—OH異構(gòu)化的基因。另外3種菌株不能產(chǎn)生3-epi-DON，可能由于它們都缺乏一種特異性還原3-keto-DON的酶。其中，德沃斯氏菌ANSB714和A16的具體降解途徑還未得到驗(yàn)證；德沃斯氏菌DDS-1是首先將DON乙?；?ADON，再氧化成3-keto-DON[31]。具有關(guān)鍵作用的3ADON氧化酶可降解小麥中58.11%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的DON和68.39%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的3ADON。第1株可降解DON衍生物——15ADON的德沃斯氏菌A16[28]的全基因組序列已被報(bào)道[32]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ANSB714可顯著減輕DON對小鼠和生長肥育豬的毒性作用，且菌株本身對實(shí)驗(yàn)生物體無害[33-34]。因此，利用ANSB714解除DON的危害在畜牧業(yè)中具有很大潛力。

德沃斯氏菌不僅可高效降解DON，還具有產(chǎn)κ-卡拉膠酶[35]、降解持久性有機(jī)污染物（POPs）[36]、有氧吸收磷[37]等潛能。有研究者[36]篩選出的德沃斯氏菌可在Aroclor1242溶液中降解60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的多氯聯(lián)苯混合物（PCBs）；郭娟娟等從角叉菜中分離得到可產(chǎn)高活力κ-卡拉膠酶的德沃斯氏菌，能特異性水解卡拉膠得到具有多種生物活性的卡拉膠寡糖，因此也可用于破除海藻細(xì)胞壁以提取其DNA[35]。目前，我國還沒有工業(yè)化的卡拉膠菌株，此菌株具有一定生產(chǎn)潛力。

1.3 諾卡氏菌屬（Nocardia）

諾卡氏菌為腐生型革蘭氏陽性菌，大多數(shù)可引起人類和動(dòng)物感染，特別是患有慢性肺病和免疫抑制性疾?。ㄈ绨滩《靖腥荆┑牟∪耍瑢?dǎo)致高死亡率[38]。它們與德沃斯氏菌產(chǎn)生不同的DON代謝物，但是降解途徑部分相同，都可產(chǎn)生3-epi-DON作為DON降解的中間體[39]。Ikunaga等從小麥地分離的諾卡氏細(xì)菌WSN05-2是第一個(gè)被報(bào)道具有DON異構(gòu)化活性的菌株，7 d的DON轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%。它可將DON降解為3-epi-DON和另一種未知產(chǎn)物，但這2種物質(zhì)只是中間產(chǎn)物[40]。

此外，該菌屬還首次被報(bào)道[41]可產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶（IFTase），催化菊糖形成雙果糖酐Ⅰ（DFAⅠ）。目前，對DFAⅠ的研究較少，此發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)大了DFAⅠ型IFTase的研究范圍，還為其晶體結(jié)構(gòu)的研究提供了理論依據(jù)。同時(shí)，也降低了DFAⅠ的合成成本。

1.4 其他細(xì)菌

有研究者[42]從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到一株名為BBSH797的厭氧細(xì)菌。該菌可以在24~48 h內(nèi)將DON的C12-C13環(huán)氧基團(tuán)水解成2個(gè)相鄰的羥基，代謝成單一產(chǎn)物DOM-1[43]，其毒性僅為DON的1/55[44]，但是它對豬或家禽沒有明顯的解毒作用[45]。目前，關(guān)于DON脫環(huán)氧化的基因還沒有被克隆，也未發(fā)現(xiàn)可在有氧條件下實(shí)現(xiàn)該降解途徑的單一菌株[46]。

近年來，研究者們還發(fā)現(xiàn)了一些新的可降解DON的菌屬，如Paradevosia屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬等。Paradevosia屬菌株具有DON降解能力[47]，可將DON完全轉(zhuǎn)化為3-epi-DON。有報(bào)道表明[48]，從土壤中分離出一株能在有氧條件下降解DON的綠膿桿菌，其上清液中的某種酶可在48 h內(nèi)降解質(zhì)量分?jǐn)?shù)64.6%的DON。李曉鳳等篩選出一株好氧腸桿菌，7 d后DON降解率可達(dá)40.40%[49]。

2 真菌的降解

除細(xì)菌外，少數(shù)真菌也對DON具有較高的降解效率（14 d內(nèi)達(dá)90%以上），主要為曲霉屬，起作用的為環(huán)氧化物水解酶。

曲霉是一類分布廣泛、穩(wěn)定性強(qiáng)的真菌，大部分可引起物質(zhì)發(fā)霉腐敗或產(chǎn)生毒素，也有部分曲霉具有降解霉菌毒素的功能。塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）具有DON生物轉(zhuǎn)化能力，降解產(chǎn)物未得到驗(yàn)證[50]。環(huán)氧化物水解酶的基因已被克隆，并分別構(gòu)建了原核和真核表達(dá)載體，且含有重組質(zhì)粒酵母菌的表達(dá)產(chǎn)物，對DON的轉(zhuǎn)化率達(dá)50%[51-53]。從米曲霉（Aspergillus oryzae）As-W.6中提取的脂肪酶（可能屬于環(huán)氧化物水解酶）對DON的降解率超過70%[54]。

環(huán)氧化物水解酶能夠高立體選擇性催化水解一系列環(huán)氧化物，得到具有光學(xué)活性的環(huán)氧化合物和鄰位二醇，且無需輔酶參與，這是獲得許多生物活性分子前體的一條重要途徑。它可應(yīng)用于不同手性藥物中間體的合成，具備一定普適性。例如，它可高效合成手性環(huán)氧氯丙烷、手性苯基乙二醇和手性芐基縮水甘油醚等原料中間體[55]。目前，已實(shí)現(xiàn)了綠豆[56]和菜豆[57]中環(huán)氧化物水解酶基因的克隆及表達(dá)。此外，曲霉屬微生物還有應(yīng)用于降解化學(xué)農(nóng)藥（有機(jī)磷類農(nóng)藥、磺酰脲類農(nóng)藥、菊酯類農(nóng)藥等）的潛力，發(fā)揮農(nóng)藥原藥作用（防治病蟲害、除草、抗病毒等）[58]。

3 混合菌的降解

人類對DON降解菌的研究是從發(fā)現(xiàn)混合菌開始的，其降解產(chǎn)物多為DOM-1。從動(dòng)物腸道和瘤胃中分離得到的混合菌株一般為厭氧菌，實(shí)際生產(chǎn)中往往因其嚴(yán)格厭氧條件而受到限制。土壤中降解DON需氧菌的發(fā)現(xiàn)為研究提供了一個(gè)新方向。20世紀(jì)80年代，有研究者[59]證明了牛瘤胃和動(dòng)物腸道中的混合微生物可將DON中的環(huán)氧結(jié)構(gòu)破壞，但是純培養(yǎng)物無作用。有研究者從褐色大頭鯰魚腸道內(nèi)容物中得到的微生物混合物C133，培養(yǎng)96 h后DON的降解率達(dá)到100%，168 h后只能檢測到DOM-1。這是魚類腸道微生物對單端孢霉烯具有轉(zhuǎn)化作用的首次報(bào)道[60]。從土壤中得到高度富集的細(xì)菌聚合體DX100（70%的菌種已知）[61]，在無氧和有氧條件下都可去除DON的環(huán)氧基團(tuán)，而某些細(xì)胞質(zhì)還原酶可能是影響脫環(huán)氧化活性的原因。如何在有氧條件下從DX100中提取脫環(huán)氧化酶或鑒定關(guān)于脫環(huán)氧化的新基因是未來研究的方向。

4 其他的降解

除微生物外，植物或一些食品加工過程也可使DON轉(zhuǎn)化為DON隱型毒素。植物感染真菌毒素后啟動(dòng)防御機(jī)制，使DON發(fā)生水解、還原、氧化反應(yīng)或與有機(jī)分子結(jié)合從而改變其結(jié)構(gòu)、極性，降低毒性，進(jìn)而促使DON隱型毒素儲存在植物液泡和質(zhì)外體中或與細(xì)胞壁發(fā)生不可逆結(jié)合[13]。D3G是植物中最常見的DON改性形式之一，糖基轉(zhuǎn)移酶將葡萄糖分子與DON分子的C3羥基結(jié)合，限制毒性基團(tuán)與靶細(xì)胞成分的相互作用。DON的熱穩(wěn)定性使其在多數(shù)加工過程中保持穩(wěn)定，但是烘焙、銑削、酸堿處理以及發(fā)酵等食品加工過程可使DON部分轉(zhuǎn)化[14]。由于缺乏暴露數(shù)據(jù)和分析標(biāo)準(zhǔn)，目前尚無法對食物中的DON隱型毒素進(jìn)行精確的風(fēng)險(xiǎn)評估[62]。此外，缺乏準(zhǔn)確的毒代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)研究，不僅限制了對霉菌毒素轉(zhuǎn)化機(jī)制的理解，還阻礙了食品中這些產(chǎn)物最大耐受水平的確定。

5 展 望

DON污染嚴(yán)重危害到谷物和糧食的質(zhì)量與安全，也對畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了較大威脅，亟待解決。生物降解法較傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法更為高效、環(huán)保，而微生物種類繁多，選擇對DON具有降解作用的菌株存在很大的研究空間。作者按照菌屬分類，綜述了近10年可降解DON的菌株，發(fā)現(xiàn)降解機(jī)制研究得最為深入的是德沃斯氏菌，已明確并克隆了其降解酶的基因。芽孢桿菌報(bào)道的次數(shù)較多，但是研究深度僅停留在其對DON的降解效果上，代謝產(chǎn)物及其毒性均未得到明確。

從監(jiān)管、毒理學(xué)和消費(fèi)者方面考慮，微生物降解在人類食品和動(dòng)物飼料工業(yè)中的應(yīng)用受到局限。降解菌株的安全性至關(guān)重要，菌株本身是否無毒決定了其是否有應(yīng)用價(jià)值，但是其功效研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，對人體及動(dòng)物產(chǎn)生的影響研究有限，仍需要大量毒理學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證。目前，DON的降解機(jī)制、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及其毒性有待進(jìn)一步探究，距離滿足實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還有一定差距。因此，不僅要篩選更高效的降解菌株，也要健全和完善安全性評價(jià)和降解機(jī)理的研究。

未來可應(yīng)用降解酶和基因以優(yōu)化降解DON的生物方法。從微生物、植物和哺乳動(dòng)物組織中純化和鑒定降解酶，研究其性質(zhì)和活性。利用基因工程技術(shù)識別和表征降解酶的相關(guān)基因，使其被克隆并在作物中表達(dá)，培育出能抑制DON產(chǎn)生或能降解DON的品種，以防止DON進(jìn)入人類和動(dòng)物的食物鏈，影響食品安全。此外，降解基因還可能在微生物中表達(dá)，從而產(chǎn)生用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)和純化酶的重組微生物，為處理DON污染的飼料和糧食提供行之有效的技術(shù)和策略，確保糧食和食品安全，保護(hù)消費(fèi)者健康。