谷麗麗，高永英，陳寧寧

（河南省直第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000）

認(rèn)知功能障礙是帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）患者常見非運(yùn)動癥，報(bào)道指出，約25%-60%的PD患者可能會并發(fā)認(rèn)知功能障礙，且30%左右的患者在就診時(shí)已合并認(rèn)知功能障礙[1]。輕微認(rèn)知功能障礙雖不會對PD患者日常生活造成嚴(yán)重影響，但隨著認(rèn)知功能障礙程度的加重，可能會進(jìn)展為癡呆，降低患者生活質(zhì)量[2]。因此，明確可能與PD患者認(rèn)知功能障礙的相關(guān)指標(biāo)，對指導(dǎo)早期干預(yù)、遏制疾病進(jìn)展尤為重要。蒙特利爾認(rèn)知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）是臨床評估認(rèn)知功能障礙常用方法，該方式雖可明確患者認(rèn)知功能，但其所獲結(jié)果容易無法定量評估PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)用受限[3]。微小RNA（microRNA，miR）是一種內(nèi)源性小分子單鏈RNA，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等作用，且miR-221與心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。β淀粉樣蛋白1-42（Amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42）是淀粉樣前體蛋白降解產(chǎn)物，其具有神經(jīng)毒性，可促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元變性，推進(jìn)PD疾病進(jìn)展[5]。結(jié)合miR-221、Aβ1-42作用機(jī)制猜測,二者可能與PD患者認(rèn)知功能障礙有關(guān)，但具體關(guān)系尚未明確。鑒于此，本研究重在分析血清miR-221、Aβ1-42水平與PD患者認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究的實(shí)施獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。前瞻納入醫(yī)院2018年5月-2020年6月就診的113例PD患者為研究對象，患者及家屬均知情此項(xiàng)研究，且簽署研究知情同意書。113例患者中男53例，女60例；年齡57～71歲，平均（63.59±2.16）歲；病程1～7年，平均（4.33±0.65）年；受教育程度：初中及以下48例，高中或中專41例，?？萍耙陨?4例。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) ⑴納入標(biāo)準(zhǔn)：PD符合《中國帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)(2016版)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)臨床體征、影響學(xué)檢查等確診；首次就診；視覺、聽覺正常，具備基礎(chǔ)閱讀能力，可配合研究。⑵排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病、腎衰竭等重要臟器病變；既往有癡呆、精神病或其他中樞系統(tǒng)疾??；合并感染性疾病；既往有腦卒中病史或顱腦損傷史；合并腦血管疾??；合并惡性腫瘤；合并炎癥疾??；近1個(gè)月接受相關(guān)治療。

1.3 方法

1.3.1 認(rèn)知功能障礙評估及分組 于患者入院時(shí)，采用MoCA[7]評估患者認(rèn)知功能障礙情況，量表包括注意與集中、執(zhí)行能力、語言、視空間技能、抽象思維、記憶、計(jì)算和定向力等領(lǐng)域，共有11個(gè)項(xiàng)目，量表得分范圍于0-30分，得分越高表示認(rèn)知功能較好；將MoCA得分＜26分患者納入認(rèn)知功能障礙組，反之則納入認(rèn)知功能正常組。

1.3.2 血清miR-221、Aβ1-42水平檢測 于患者入院時(shí)，采集其空腹肘部靜脈血5ml，采用低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司，型號：TDL-5-A）以4000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，離心半徑為10cm，采集血清分別置于2支無菌干燥試管內(nèi)，其中一支用于血清miR-221檢測，檢測方法：將血清樣本置于4℃環(huán)境下，用高速離心機(jī)（長沙湘悅離心機(jī)有限公司，型號：TG16-X）以12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，離心半徑為8cm，去除紅細(xì)胞后，用mirVana RNA Isolation Kit提取樣本RNA，然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)提取樣本cDNA；逆轉(zhuǎn)結(jié)束進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增反應(yīng)，用TaqMan miRNA Assays建立20μl反應(yīng)體系[逆轉(zhuǎn)錄引物2μl、10μmol/L miRNA-21上游與下游引物各0.6μl、緩沖液4μl、DEPC水12.15μl、50×ROX 0.25μl、10μmol/L TaqM按MGB探針0.4μl]，然后熒光定量PCR儀（濟(jì)南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司，型號：Lepgen-96）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件：95℃環(huán)境下反應(yīng)30s，設(shè)定1個(gè)循環(huán)；后分別在95℃環(huán)境下反應(yīng)5s、60℃環(huán)境下反應(yīng)34s，設(shè)定40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束用2-△△CT法分析miR-221表達(dá)，檢驗(yàn)所有相關(guān)試劑均購自美國Ambion公司。另一支用于血清Aβ1-42檢測，檢測方法：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定Aβ1-42水平，檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，檢驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 基線資料采集 設(shè)計(jì)基線資料填寫表，詢問并記錄患者相關(guān)基線資料，內(nèi)容包括：性別（男、女）、年齡、病程、受教育程度（初中及以下、高中或中專、?？萍耙陨希⒑喜⒒A(chǔ)疾病[高血壓：收縮壓水平≥140mmHg，舒張壓水平≥90mmHg；糖尿?。嚎崭寡撬健?.0mmol/L，和（或）餐后2h血糖水平≥11.1mmol/L]、病情分期[根據(jù)Hoehn-Yahr分期[8]（H&Y）評估,早期（H&Y分期＜Ⅱ期）、中期（H&Y分期于Ⅱ-Ⅲ期）、晚期（H&Y分期＞Ⅲ期）]等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，用χ2檢驗(yàn)；等級資料采用秩和檢驗(yàn)；全部計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用“”表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；經(jīng)Logistic回歸分析，檢驗(yàn)血清miR-221、Aβ1-42水平與PD患者認(rèn)知功能障礙的關(guān)系；繪制受試者工作曲線（Receiver operator characteristic，ROC），并計(jì)算曲線下面積（Area Under Curve，AUC），檢驗(yàn)血清miR-221、Aβ1-42水平預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值，AUC值＞0.9表示預(yù)測性能較高，0.71-0.90表示有一定預(yù)測性能，0.5-0.7表示預(yù)測性能較差；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD患者認(rèn)知功能障礙情況113例PD患者中,有34例伴有認(rèn)知功能障礙,占30.09%（34/113）,平均MoCA得分為23.00（20.00，25.00）分；79例認(rèn)知功能正常，占69.91%（79/113），平均MoCA得分為27.00（26.00，30.00）分。

2.2 認(rèn)知功能障礙、正常PD患者相關(guān)基線資料比較 認(rèn)知功能障組血清miR-221水平高于認(rèn)知功能正常組，Aβ1-42水平低于認(rèn)知功能正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間其他基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 認(rèn)知功能障礙、正常PD患者相關(guān)基線資料比較

2.3 血清miR-221、Aβ1-42水平與PD患者認(rèn)知功能障礙的關(guān)系回歸分析 將2.2中比較差異有意義的變量miR-221、Aβ1-42納入作為自變量（均為連續(xù)變量），將PD患者認(rèn)知功能情況作為因變量（1=認(rèn)知功能障礙，0=認(rèn)知功能正常），經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-221、Aβ1-42異常表達(dá)與PD患者認(rèn)知功能障礙有關(guān)，miR-221升高可能是PD患者認(rèn)知功能障礙的影響因子（OR＞1，P＜0.05）；Aβ1-42升高可能是PD患者認(rèn)知功能障礙的保護(hù)因子（OR＜1，P＜0.05）。見表2。

表2 血清miR-221、Aβ1-42水平與PD患者認(rèn)知功能障礙的關(guān)系回歸分析結(jié)果

2.4 血清miR-221、Aβ1-42水平預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值分析 繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)（見圖1），血清miR-221、Aβ1-42單一及聯(lián)合預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)的AUC分別為0.864、0.813、0.933，AUC均＞0.80，均有一定預(yù)測價(jià)值，且當(dāng)二者cut-off值分別取28.305、1.135μg/L時(shí)，預(yù)測價(jià)值最佳。相關(guān)參數(shù)見表3。

圖1 血清miR-221、Aβ1-42水平預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值的ROC曲線圖

表3 血清miR-221、Aβ1-42水平預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值分析結(jié)果

3 討論

研究指出，miR與神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的發(fā)生密切相關(guān)，miR可結(jié)合靶向mRNA非翻譯區(qū)，導(dǎo)致miR逆轉(zhuǎn)錄沉默，從而抑制mRNA翻譯，而mRNA表達(dá)缺失，會造成特異性蛋白含量升高，繼而引發(fā)相應(yīng)神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[9]。α-突觸核蛋白（αsynuclein，α-Syn）聚集所致的多巴胺神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元損傷是PD發(fā)生的主要原因之一，而miR-221可調(diào)控α-Syn表達(dá)[10]。既往miR-221多用于惡性腫瘤診斷，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-221可調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)鐵蛋白受體2表達(dá)，誘導(dǎo)鐵元素聚集，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、線粒體功能障礙等，從而促進(jìn)PD發(fā)生與發(fā)展[11]。同時(shí)，免疫炎癥反應(yīng)已被證實(shí)是PD進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，而miR-221可激活炎癥信號通路，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[12]。Aβ1-42蛋白主要表達(dá)于大腦中，通常情況下，腦內(nèi)Aβ1-42生成、降解相對平衡，經(jīng)β-分泌酶途徑可轉(zhuǎn)化為胰島素降解酶于腦啡肽酶，且血-腦脊液屏障Aβ可利用高級糖基化產(chǎn)物受體向腦內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)和低密度脂蛋白相關(guān)蛋白1向外轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ1-42，從而維持血-腦Aβ1-42平衡[13]。但血-腦Aβ1-42表達(dá)失衡，會導(dǎo)致Aβ1-42異常聚積，而Aβ1-42具有神經(jīng)毒性，可能會導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元退行性病變[14]。此外，相關(guān)研究表明，Aβ1-42會誘導(dǎo)一氧化氮生成，引發(fā)炎癥級聯(lián)與氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷腦蛋白質(zhì)與膜性結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，推進(jìn)PD發(fā)展[15]。

為驗(yàn)證血清miR-221、Aβ1-42可能與PD患者認(rèn)知功能障礙有關(guān)假設(shè)，本研究初步比較認(rèn)知功能障礙、認(rèn)知功能正常PD患者相關(guān)基線資料，后經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-221、Aβ1-42異常表達(dá)與PD患者認(rèn)知功能障礙有關(guān)，miR-221升高可能是PD患者認(rèn)知功能障礙的影響因子，Aβ1-42升高可能是PD患者認(rèn)知功能障礙的保護(hù)因子，證實(shí)猜測。分析原因在于，miR-221水平升高會促進(jìn)α-Syn生成，加重神經(jīng)元損傷，從而加重病情嚴(yán)重程度，增加PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)[16]。血清Aβ1-42水平降低，會導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ1-42大量聚積，損傷多巴胺神經(jīng)元，且可能會引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重腦蛋白質(zhì)損傷，從而加重病情，引發(fā)PD患者認(rèn)知功能障礙[17]。進(jìn)一步繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，血清miR-221、Aβ1-42預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)有理想的價(jià)值，在二者cut-off值分別取28.305、1.135μg/L時(shí)，可獲得最佳預(yù)測價(jià)值，且隨著miR-221表達(dá)升高，Aβ1-42水平降低，患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加。針對此結(jié)果建議，于PD患者入院時(shí)臨床應(yīng)檢測miR-221、Aβ1-42水平，輔助評估患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)，且對于認(rèn)知功能障礙的患者，應(yīng)盡早予以腦循環(huán)改善劑、能量代謝激活劑、神經(jīng)生長因子保護(hù)劑等對癥治療，以遏制疾病進(jìn)展。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-221、Aβ1-42聯(lián)合檢測預(yù)測PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值高于各項(xiàng)單一檢測，考慮未來可將二者結(jié)合觀察，以提高患者整體獲益。但本研究并未對患者進(jìn)行長期隨訪，無法明確血清miR-221、Aβ1-42與PD患者認(rèn)知功能障礙進(jìn)展的關(guān)系，研究存有局限，未來仍需展開前瞻性研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，PD患者認(rèn)知功能障礙可能與患者血清miR-221升高、Aβ1-42降低有關(guān)，考慮未來可檢測患者入院時(shí)血清miR-221、Aβ1-42水平，輔助評估PD患者認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)。