陳東玉，黨惠兵，臧玉柱，周可樹(shù)

（1.方城縣人民醫(yī)院血液腫瘤科，河南 南陽(yáng) 473200；2.南陽(yáng)醫(yī)專一附院血液科，河南 南陽(yáng) 473200；3.河南省人民醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450000；4.河南省腫瘤醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450000）

急性淋巴細(xì)胞白血病 （Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童常見(jiàn)的惡性腫瘤性疾病，約占兒童白血病的70%，隨著化療及分層治療的完善，約80%的兒童可獲得較長(zhǎng)生存期[1]。但中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的發(fā)生可導(dǎo)致患兒死亡率增加，生存期縮短,也是多數(shù)ALL患兒治療失敗的主要原因之一[2]。早期診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病可及時(shí)處理和治療，改善患兒生存期[3]，但目前其診斷主要依靠腦脊液腦脊液細(xì)胞學(xué)（Cerebrospinal fluid cytology，CC）檢查中異型白細(xì)胞，CC檢查常受到標(biāo)本及制片等人為影響,仍存在部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病漏診[4]，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病檢出率是臨床亟待解決難題。因此本研究觀察腦脊液流式細(xì)胞學(xué)檢查（Flow cytometry，F(xiàn)CM）在鑒別診斷小兒ALL并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病中價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 患兒資料 選取2013年6月30日至2018年6月30日本院收治的98例首診ALL患兒。選取標(biāo)準(zhǔn)：在我院首診為ALL，既往未接受其他白血病相關(guān)治療；符合ALL診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；臨床資料完整；患兒家屬對(duì)研究知情且簽署本研究相關(guān)同意書(shū)。排除合并自身免疫性疾病、其他血液系統(tǒng)疾?。ㄈ绻撬柙錾惓＞C合癥等）、先天性疾病、慢性肝臟疾病、慢性腎臟疾病、心臟病、內(nèi)分泌疾病患兒。

1.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病診斷標(biāo)準(zhǔn) 可存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)臨床特征：頭痛、抽搐、嘔吐、視網(wǎng)膜出血、口角歪斜、視物模糊以及視乳頭水腫等；腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查見(jiàn)白血病細(xì)胞；排除其他疾?。ㄈ缒X炎）等引起的相似性改變；顱內(nèi)壓＞0.02kPa，腦脊液中白細(xì)胞>106/L。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考[6]。

1.3 檢測(cè)方法 患兒均接受腰椎穿刺取腦脊液樣本,要求一次成功，避免穿刺損傷對(duì)樣本造成影響。對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行常規(guī)生化檢測(cè)。取第一次腦脊液檢查的標(biāo)本進(jìn)行FCM和CC檢查。

1.3.1 CC檢測(cè)方法 取0.1ml腦脊液樣本吹打混合均勻，放入離心管，離心1min（200×g），制作腦脊液涂片，并進(jìn)行瑞氏染色，待自然晾干后放于顯微鏡下觀察涂片中細(xì)胞形態(tài)。CC陽(yáng)性指涂片中見(jiàn)幼稚原始白血病細(xì)胞，否則為陰性。

1.3.2 FCM檢測(cè)方法 取約2ml腦脊液樣本，離心后取沉淀細(xì)胞放入試管中，加入紅細(xì)胞裂解液。根據(jù)免疫分型結(jié)果（初診時(shí)免疫表型表達(dá)最強(qiáng)者）選擇20μl單克隆抗體（美國(guó)BD公司提供）加入試管中，室溫避光15min后加PBS定容，進(jìn)行FCM檢測(cè)。患兒均使用CD34及CD45單抗標(biāo)記。FCM陽(yáng)性指腦脊液未被血液污染且可檢測(cè)到白血病細(xì)胞免疫表型或腦脊液混血后白血病細(xì)胞免疫表型高于外周血中幼稚細(xì)胞，否則為陰性。

1.4 觀察指標(biāo) ⑴兩種檢測(cè)方法對(duì)異形細(xì)胞的檢出率。⑵兩種檢查方法對(duì)CNS狀態(tài)的檢出情況，根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)、影像學(xué)結(jié)果及CC結(jié)果將ALL分為CNS-1、CNS-2、CNS-3。CNS-1指CC陰性且無(wú)CNS相關(guān)臨床及影像學(xué)表現(xiàn)；CNS-2：腰穿無(wú)損傷時(shí)CC檢測(cè)中白細(xì)胞數(shù)≤5/μl，且可見(jiàn)白血病細(xì)胞，腰穿損傷時(shí)CC檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)白血病細(xì)胞或血性腦脊液中白細(xì)胞數(shù)>50×109/L；CNS-3：CC陽(yáng)性或出現(xiàn)CNS相關(guān)臨床及影像學(xué)表現(xiàn)。⑶兩種方法對(duì)腦壓增高患兒、腦脊液蛋白陽(yáng)性患兒、腦脊液血糖增高患兒異常細(xì)胞的檢出率。⑷根據(jù)患兒病情、年齡、白細(xì)胞數(shù)、化療反應(yīng)、微小殘留病、激素預(yù)治療反應(yīng)、免疫分型等將患兒分為標(biāo)危、高危及中危[6]，比較兩種方法對(duì)標(biāo)危、高危及中危的檢出情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)，F(xiàn)CM和CC檢出率比較使用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒資料98例ALL患兒年齡3～14歲，平均（6.5±2.1）歲，男51例，女47例，隨訪時(shí)間12～42月，中位隨訪時(shí)間32個(gè)月，死亡14例，復(fù)發(fā)8例，4例放棄治療。共4例患兒確診為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，其中3例FCM陽(yáng)性且CC陽(yáng)性，1例FCM陰性且CC陰性。特殊融合基因Tel/AML1 15例，Bcr/ab1 p210 2例，Bcr/ab1 p190 5例，TKD 2例，MLL/AF4 5例。

2.2 FCM和CC對(duì)異形細(xì)胞的檢出率FCM檢出24例患兒腦脊液中存在異形細(xì)胞,檢出率為24.5%；CC檢出11例患兒腦脊液中存在異常細(xì)胞，檢出率為11.2%，F(xiàn)CM對(duì)異形細(xì)胞檢出率高于CC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表1。

表1 FCM和CC對(duì)異形細(xì)胞的檢出率

2.3 FCM和CC對(duì)不同患兒異形細(xì)胞的檢出率在腦脊液蛋白質(zhì)陽(yáng)性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒中，F(xiàn)CM對(duì)異形細(xì)胞的檢出率均高于CC患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而兩種檢查方法在腦脊液蛋白質(zhì)陰性、腦壓正常、腦脊液血糖正常患兒中對(duì)異形細(xì)胞的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表2。

表2 FCM和CC對(duì)不同患兒異形細(xì)胞的檢出率

2.4 FCM和CC對(duì)CNS狀態(tài)及危險(xiǎn)度的檢出情況FCM和CC陽(yáng)性患者CNS狀態(tài)及危險(xiǎn)度分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但FCM對(duì)CNS-1、中度患者檢出率高于CC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。表3。

表3 FCM和CC對(duì)CNS狀態(tài)及危險(xiǎn)度的檢出情況

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病是小兒ALL治療失敗和疾病進(jìn)展的重要因素，早期診斷和治療可提高生存期、降低患兒死亡率[7,8]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的診斷依賴于腦脊液CC檢查發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞，但腦脊液中白血病細(xì)胞數(shù)量較少，且容易受到人為因素的影響，診斷檢出率仍待提高[9]。目前FCM已被AIEOP-BFM共識(shí)指南（2016年）推薦用于兒童ALL診斷中，但其在診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病中價(jià)值有待研究[10]。

本研究共納入98例ALL患兒，共4例患兒確診為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病，發(fā)病率為4.0%，既往研究報(bào)道，ALL發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病幾率為2.0%～6.6%，本研究與既往研究報(bào)道相符[11]。本研究中4例中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病患兒中3例FCM陽(yáng)性且CC陽(yáng)性，1例FCM陰性且CC陰性，提示FCM和CC診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病檢出率差異不大，由于本研究病例數(shù)較少，中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)病率低，該結(jié)論仍需進(jìn)一步證實(shí)。1例FCM陰性且CC陰性可能與該患兒腦膜未被腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)造成。

既往研究報(bào)道，F(xiàn)CM在成人ALL患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的診斷效果優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查，敏感性更高[12]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)CM對(duì)異形細(xì)胞檢出率（24.5%）高于CC（11.2%），且在腦脊液蛋白質(zhì)陽(yáng)性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒中，F(xiàn)CM對(duì)異形細(xì)胞的檢出率顯著高于CC患兒,提示FCM在鑒別診斷小兒ALL并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病中價(jià)值優(yōu)于CC，尤其是腦脊液蛋白質(zhì)陽(yáng)性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒中。譚惠珍等[13]研究報(bào)道，F(xiàn)CM檢查診斷ALL中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的敏感性高于CC，F(xiàn)CM聯(lián)合CC可提高ALL中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的檢出率。Quijano等[14]研究證實(shí)，F(xiàn)CM可使ALL中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)患兒腦脊液中異型細(xì)胞的檢出率提高75%，本研究也證實(shí)FCM對(duì)異形細(xì)胞檢出率更高，與既往研究結(jié)果相符。董德明等[15]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)CM腦脊液檢測(cè)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)檢出率高，尤其是腦壓增高患兒，與本研究結(jié)果相符。

本研究中，F(xiàn)CM和CC陽(yáng)性患者CNS狀態(tài)及危險(xiǎn)度分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,提示FCM和CC陽(yáng)性對(duì)CNS狀態(tài)及危險(xiǎn)度分布診斷價(jià)值相當(dāng)，但FCM對(duì)CNS-1、中度患者檢出率高于CC，提示FCM對(duì)CNS-1及中度危險(xiǎn)患兒的敏感性更高。而FCM對(duì)CNS-2、CNS-3敏感性與CC相當(dāng)。楊文鈺等[6]研究證實(shí)，腦脊液FCM是CC檢查的重要補(bǔ)充,對(duì)CNS-2、CNS-3檢出能力與CC具有高度一致性，與本研究結(jié)果相符。但由于本研究為單中心研究，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病發(fā)病率低，病例數(shù)有限，研究結(jié)果仍待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，F(xiàn)CM在鑒別診斷小兒ALL并中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病中價(jià)值優(yōu)于CC，尤其是腦脊液蛋白質(zhì)陽(yáng)性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒，且對(duì)CNS狀態(tài)及危險(xiǎn)度的敏感性高。