李林飛，宋銀森，李東曉，李嫻，趙鼎

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

急性髓系白血病M2型(acute myeloid leukemia-M2,AML-M2)是一類髓系造血干/祖細(xì)胞惡性克隆性疾病，其致病基礎(chǔ)主要是細(xì)胞及分子遺傳學(xué)異常[1]。t(8;21)是急性髓系白血病M2的一種常見非隨機(jī)染色體重排，具有較強(qiáng)的規(guī)律性[2]，其易位的產(chǎn)生導(dǎo)致AML1基因重排可作為急性髓系白血病M2基因診斷的標(biāo)志。核型分析和FISH技術(shù)是常用的白血病檢測(cè)的遺傳學(xué)手段，本研究旨在深入探討兩種方法在AML-M2診治及預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值及方法學(xué)特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象2017年7月至2019年3月在我院血液腫瘤科住院的急性髓系白血病M2型兒童25例，男10例，女15例，均經(jīng)FAB骨髓形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)分型等標(biāo)準(zhǔn)確診。本研究通過鄭州兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析 在無菌條件下,抽取患兒骨髓液至少3ml，肝素鋰管抗凝，接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2天左右。加入秋水仙素后繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后收獲，常規(guī)制備染色體玻片，G顯帶，分辨率400～450條帶。用Leica GSL-10全自動(dòng)工作站，計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，分析5個(gè)左右核型，當(dāng)核型結(jié)果不一致時(shí)，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)大計(jì)數(shù)量并加數(shù)核型。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制ISCN2009加以描述。

1.2.2 熒光原位雜交技術(shù) 應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)，采用AML1/ETO雙融合基因探針(英國(guó)Cytocell公司),ETO(8q22)基因探針標(biāo)記為綠色，AML1(21q22)基因標(biāo)記為紅色。在Leica GSL-10全自動(dòng)工作站熒光顯微鏡下觀察間期細(xì)胞雜交信號(hào),Cytovision軟件進(jìn)行熒光圖像分析，共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞雜交信號(hào)，陽性細(xì)胞所占比例達(dá)10%以上可提示陽性結(jié)果。正常細(xì)胞內(nèi)顯示的雜交信號(hào)為2個(gè)綠色及2個(gè)紅色信號(hào)，均不在同一點(diǎn)上，無融合信號(hào)發(fā)生；發(fā)生AML1/ETO融合的陽性細(xì)胞內(nèi)至少顯示一個(gè)以上黃色融合信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩種方法學(xué)比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在25例AML-M2兒童中，核型分析檢出t(8;21)染色體易位17例(68%)，包括除典型t(8;21)及其它染色體異常，如復(fù)雜易位、缺失、額外染色體等，核型正常5例(20%),其中4例為復(fù)診兒童,3例(12%)標(biāo)本因細(xì)胞生長(zhǎng)不良，制片質(zhì)量差，無法分析；25例AML-M2兒童同時(shí)做FISH，檢出陽性20例(80%)，包括17例t(8;21)及3例無分裂相的標(biāo)本，4例復(fù)診兒童均為陰性，檢出信號(hào)異常1例(4%)，但無陽性改變。17例AML-M2兒童易位染色體核型見表1。

表1 17例AML-M2兒童易位染色體核型分布

本研究中染色體核型分析對(duì)t(8;21)的檢出率與熒光原位雜交(FISH)對(duì)AML1/ETO融合基因的檢出率進(jìn)行比較，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.936，P=0.333)，見表2。

表2 兩種方法檢出率比較

3 討論

伴t(8；21)染色體易位或AML1-ETO融合基因陽性急性髓系白血病已被世界衛(wèi)生組織劃分為獨(dú)立亞型,出現(xiàn)在約10%～20%兒童急性髓系白血病病例中[3]，為目前兒童AML最常見的分子細(xì)胞遺傳學(xué)改變，具有高度的異質(zhì)性[4],臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、鼻衄、面部蒼白、皮膚瘀斑、黏膜出血點(diǎn)、血象異常等，多見髓外侵犯,常伴有附加核型異常[5]。

t(8；21)/AML1-ETO融合基因陽性常見于兒童AML的FAB分型中M2型，尤其在M2b亞型中出現(xiàn)率高達(dá)80%以上，M1,M4亦可見，偶見于骨髓增生異常綜合癥（MDS）[6]。M2b主要是以異常的中性中幼粒細(xì)胞為主[7]，因此類患者化療完全緩解率較高，生存期也較長(zhǎng)，其被認(rèn)為是預(yù)后良好組。分子及細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)對(duì)于AML-M2臨床診治及預(yù)后具有重要的臨床意義。

AML1/ETO融合基因是由于21號(hào)染色體上的急性白血病因子(acute myelogenous leukemia factor1,AML1 or RUNX1)基因易位至8號(hào)染色體上的白血病易位基因（myeloid translocation gene,ETO）而產(chǎn)成[8]，這種遺傳學(xué)改變形成融合轉(zhuǎn)錄本RU NX1-RUNX1T1，破壞了核心結(jié)合因子復(fù)合物的α亞基，進(jìn)而產(chǎn)生AML1/ETO融合蛋白，該融合蛋白能夠?qū)φＴ煅?xì)胞的增殖、分化和凋亡產(chǎn)生干擾,從而構(gòu)成了t(8;21)陽性AML發(fā)病的重要基礎(chǔ)[9]。

本研究25例AML-M2兒童G顯帶檢出t(8；21)染色體易位17例(68%)，核型正常5例(20%)，且有3例(12%)標(biāo)本因細(xì)胞生長(zhǎng)不良，制片質(zhì)量差，無法分析。而FISH檢測(cè)不受細(xì)胞培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境影響，可以分析處于各個(gè)分裂期的細(xì)胞，只需觀察熒光信號(hào)均可做出結(jié)果判讀,大大降低結(jié)果分析的難度，檢測(cè)方法更加客觀、特異、省時(shí)[10]。對(duì)于17例t(8;21)染色體易位及3例無分裂相的標(biāo)本,FISH檢測(cè)均提示陽性,表明FISH探針檢測(cè)用于AML-M2診斷較染色體核型分析有一定技術(shù)優(yōu)勢(shì),能夠降低漏檢率特別是對(duì)于無分裂相或分裂相稀少不足以顯示克隆性染色體重排的病例,進(jìn)而為臨床診斷和治療提供重要信息。但本研究中兩種方法的檢出率比較，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能跟此易位染色體相關(guān)白血病染色體畸變G顯帶技術(shù)較易檢出及標(biāo)本量有關(guān)。此外，4例復(fù)診兒童，F(xiàn)ISH結(jié)果均為陰性,表明FISH檢測(cè)在AML-M2預(yù)后的療效監(jiān)測(cè)中同時(shí)具有一定用途。

綜上所述,急性髓系白血病M2患兒特異性t(8；21)/AML1-ETO融合基因陽性改變較易檢出，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測(cè)患兒易位的敏感性較高于染色體核型分析。FISH檢測(cè)不僅可以提示融合基因是否陽性,也可提示特定基因是否異常。染色體核型分析可同時(shí)提示相關(guān)染色體是否易位及其余染色體有無畸變。因此，兩種分析方法聯(lián)合應(yīng)用可多方面提示AML-M2兒童的疾病信息,在AML-M2的診治及預(yù)后中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。