謝聞悅，聶李平，黃銘杰，李博文

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518000；2.福建省福州市長(zhǎng)樂(lè)區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，福建 福州 350299）

流式微球陣列術(shù)(cytometric bead arry,CBA)是液相多重蛋白定量技術(shù)，是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)平臺(tái)，以不同大小或攜帶不同熒光信號(hào)的微球?yàn)檩d體，能同時(shí)定量測(cè)量樣品中的多種可溶性分子和細(xì)胞因子，具有高通量、線性范圍廣、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]，該技術(shù)建立以后被廣泛地用于臨床診斷與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中[2-4]。細(xì)胞因子在檢測(cè)標(biāo)本中含量低，樣本數(shù)量少，傳統(tǒng)的方法無(wú)法滿足多因子檢測(cè)；CBA法可一次性定量檢測(cè)細(xì)胞因子多，用時(shí)短，標(biāo)本用量少，尤其適用于微量樣本。但該方法操作過(guò)程繁瑣，影響因素多，檢測(cè)過(guò)程中易受人為因素影響[5，6]，因而如何保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定可靠尤為重要。由于目前市場(chǎng)中尚無(wú)商品化的穩(wěn)定質(zhì)控物，也未見(jiàn)關(guān)于細(xì)胞因子質(zhì)控方法建立的文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室擬通過(guò)自制質(zhì)控品，初步探討建立CBA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子的室內(nèi)質(zhì)控方法，為及時(shí)找出測(cè)定誤差，以保證細(xì)胞因子檢測(cè)的質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備及試劑

1.1.1 儀器 貝克曼navios流式細(xì)胞儀。

1.1.2 試劑Aim Plex多因子流式檢測(cè)IFN-r/IL-8試劑盒(北京曠博生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 分析軟件FCAPS流式細(xì)胞分析軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)控品的制備

1.2.1.1 陽(yáng)性血漿 吸取2019年12月一名CAR-T治療后出現(xiàn)2級(jí)細(xì)胞因子風(fēng)暴（CRS）患者EDTA抗凝血漿1ml，其IL-10檢測(cè)結(jié)果為130.26ng/L，IL-8檢測(cè)結(jié)果為127.5ng/L。

1.2.1.2 陰性血漿 吸取2019年12月來(lái)本院體檢的健康體檢者EDTA抗凝血漿各1ml，IL-10檢測(cè)結(jié)果分別為0.52ng/L、0.73ng/L，IL-8檢測(cè)結(jié)果分別為1.32ng/L、2.17ng/L。

1.2.1.3 將陽(yáng)性血漿與陰性血漿混合后,分裝為60 ul/管，-80℃迅速凍存。

1.2.2 操作步驟 按照試劑操作說(shuō)明書(shū)，標(biāo)準(zhǔn)品被稀釋成7個(gè)梯度濃度，和自制質(zhì)控樣本各取45μl與IL-10/IL-8微球混懸液45μl室溫混合避光震蕩孵育1h，洗滌后加入二抗25μl混合震蕩孵育30min,二次洗滌后加入鏈合親霉素-PE25ul震蕩孵育30min后,洗滌加入讀數(shù)液200μl上機(jī)獲取數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 打開(kāi)FCAPS軟件創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，建立?biāo)準(zhǔn)曲線,設(shè)門(mén)圈出樣本微球，計(jì)算樣本濃度。

1.3 質(zhì)控方法 本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控方法先采用“即刻法”，當(dāng)每個(gè)質(zhì)控品種檢測(cè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)超過(guò)20個(gè)后，轉(zhuǎn)入使用Levey-Jennings(L-J)質(zhì)控圖法。

1.3.1 “即刻法”的建立 按文獻(xiàn)做法[7]，先測(cè)定兩次質(zhì)控值，從第三次開(kāi)始，每次計(jì)算其平均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s，再根據(jù)公式SI上限=(x最大值-x)/s,SI下限=(x-x最小值)/s算出SI值,將其值與SI界值表中數(shù)據(jù)作比較。當(dāng)SI上限和S1下限都小于其界值表中n2s的值時(shí)，說(shuō)明其結(jié)果可靠處于在控，可以繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)其中有一個(gè)值大于界值表的n2s且小于n3s時(shí)，該狀態(tài)處于警告，當(dāng)其中有一個(gè)值大于n3s時(shí)，則說(shuō)明該質(zhì)控結(jié)果處于失控狀態(tài)，對(duì)于失控和警告狀態(tài)的值，選擇舍去一個(gè)離散程度最大的值。

表1 SI值表

1.3.2 Levey—Jennings質(zhì)控方法建立 在測(cè)定20次的質(zhì)控值后，計(jì)算出其平均值，以及標(biāo)準(zhǔn)差s，按westgard的3s標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，即以x±3s作圖建立一個(gè)質(zhì)控框架圖，將同批質(zhì)控品和檢測(cè)試劑測(cè)定的結(jié)果描人上述所做的質(zhì)控圖中，當(dāng)描入的質(zhì)控值大于x+3s或小于x-3s時(shí)，即說(shuō)明該質(zhì)控值已處于失控狀態(tài)，對(duì)于這樣的值，需要尋找失控的原因，并重新測(cè)定該值。

2 結(jié)果

2.1 IL-10質(zhì)控結(jié)果 表2為IL-10即刻法結(jié)果，圖1是按表2數(shù)據(jù)所做的L—J法質(zhì)控圖(x=43.23，SD=5.90)。IL-10即刻法未見(jiàn)警告或失控?cái)?shù)據(jù)，而在L—J法中第13點(diǎn)(30.26)大于x-2s小于x-3s，判定結(jié)果為警告狀態(tài)，其余結(jié)果在控。見(jiàn)表2，圖1。

圖1 IL-10 20個(gè)質(zhì)控測(cè)定值應(yīng)用L—J法繪制質(zhì)控圖(x=43.23，SD=5.90，CV=13.66%)

表2 IL-10 20個(gè)質(zhì)控值應(yīng)用即刻法繪制質(zhì)控表

2.2 IL-8質(zhì)控結(jié)果 表3為IL-8即刻法20次測(cè)定結(jié)果，圖2是按表3數(shù)據(jù)所做的L—J法質(zhì)控圖(x=50.11，SD=9.28，CV=18.52%)。即刻法第4組數(shù)據(jù)出現(xiàn)告警，而L-J圖顯示在控狀態(tài)；第20組數(shù)據(jù)則即刻法、L-J圖同時(shí)出現(xiàn)警告。在剔除第4點(diǎn)告警值后，發(fā)現(xiàn)即刻法第13點(diǎn)數(shù)據(jù)告警狀態(tài)浮現(xiàn),見(jiàn)表4。剔除即刻法3次告警值并補(bǔ)充第21、22、23點(diǎn)測(cè)定值（分別是58.71、34.77、57.71）后，重新計(jì)算IL-8的均值、變異系數(shù)為x=47.86，SD=7.27，CV=15.19%。

表4 IL-8刪除第4點(diǎn)告警值后部分?jǐn)?shù)據(jù)即刻法質(zhì)控表

圖2 IL-8前20個(gè)質(zhì)控測(cè)定值應(yīng)用L—J法繪制質(zhì)控圖(x=50.11，SD=9.28，CV=18.52%)

表3 IL-8前20個(gè)質(zhì)控值應(yīng)用即刻法繪制質(zhì)控表

3 討論

細(xì)胞因子在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，檢測(cè)其含量有助于判斷疾病活動(dòng)程度，因此細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性對(duì)于臨床的治療有著非常重要的影響。隨著細(xì)胞因子檢測(cè)在臨床的廣泛應(yīng)用，建立好室內(nèi)質(zhì)量質(zhì)控（ICQ)保證樣本測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性有著非常重要的意義。

在日常的室內(nèi)質(zhì)控工作中，大多數(shù)的定量檢驗(yàn)項(xiàng)目都采用Levey—Jennings圖作為常規(guī)的質(zhì)控方法。但L-J質(zhì)控圖通常需要作20次測(cè)定才可繪成，在此之前，不能對(duì)檢測(cè)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。因此對(duì)于類似CBA法檢測(cè)細(xì)胞因子這類檢測(cè)頻次低，不能迅速進(jìn)行質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)積累的檢驗(yàn)項(xiàng)目,迫切需要另一個(gè)能比較及時(shí)反映檢測(cè)過(guò)程是否在控的質(zhì)控方法。

“即刻法”是一種對(duì)離群值進(jìn)行檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法，實(shí)質(zhì)上是將數(shù)據(jù)處理過(guò)程中對(duì)異常值(即離群值)的判斷及舍棄的方法[8]。其優(yōu)點(diǎn)是只需要連續(xù)測(cè)定三次，即可對(duì)第3次及以后的數(shù)據(jù)進(jìn)行在控與失控的判斷，操作簡(jiǎn)單、易于掌握[8，9]。在本文中，我們運(yùn)用“即刻法”分別監(jiān)控IL-10、IL-8初期的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大部分的數(shù)據(jù)都未處于告警或失控，這說(shuō)明檢測(cè)過(guò)程在控，即刻法用于細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控是可行的。在積累20個(gè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)法后即轉(zhuǎn)為L(zhǎng)-J圖后，我們發(fā)現(xiàn)IL-10即刻法數(shù)據(jù)雖未出現(xiàn)失控現(xiàn)象，但轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-J圖后仍可發(fā)現(xiàn)第13點(diǎn)數(shù)為大于2s的警告狀態(tài)，這說(shuō)明“即刻法”有時(shí)并不能對(duì)告警或失控做到“實(shí)時(shí)”判斷,所以其“即刻性”是相對(duì)的[8]。由于即刻法是從當(dāng)天及以前的所有測(cè)定值中找出最大值和最小值，在室內(nèi)質(zhì)控時(shí)，測(cè)定次數(shù)較少時(shí)有些離群值可能不一定會(huì)顯示失控，但隨著測(cè)定次數(shù)的增加，測(cè)定值逐漸趨于穩(wěn)定，這時(shí)以前的離群值將“暴露”出來(lái)顯示為失控，對(duì)于這類數(shù)據(jù)值有的研究者被稱之為“遲后異常值”[9]，這種現(xiàn)象被稱為“回顧性失控檢出”現(xiàn)象[10]，這是即刻法的一大缺陷。在IL-8的質(zhì)控檢測(cè)中我們還發(fā)現(xiàn)，即刻法第4組數(shù)據(jù)出現(xiàn)告警，而L-J圖顯示在控狀態(tài)；而刪除第4點(diǎn)后，又出現(xiàn)了第12點(diǎn)告警值，但仔細(xì)觀察數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)第11點(diǎn)數(shù)據(jù)（63.13）較第12點(diǎn)數(shù)據(jù)（43.55）偏離質(zhì)控 均值 更遠(yuǎn)，出現(xiàn)了“距均值近的測(cè)定值被判告警,而距均值遠(yuǎn)的測(cè)定值在控”的不合理現(xiàn)象，有人[10]認(rèn)為出現(xiàn)這種SI上限或SI下限值>n2S值時(shí),說(shuō)明該組測(cè)定值中最大值或最小值告警了,而并非末次測(cè)定值告警。因此，我們舍棄了即刻法出現(xiàn)告警的第4、20點(diǎn)數(shù)據(jù)以及實(shí)際超出了前10次累加計(jì)算在之外的異常值——第11點(diǎn)數(shù)據(jù)，補(bǔ)充了第21、22、23點(diǎn)數(shù)據(jù)后，重新計(jì)算均值和變異系數(shù)，顯而易見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)差變小，數(shù)據(jù)間離散程度（CV%)也變小了。

即刻法的另一不足之處，在于不能判斷連續(xù)趨勢(shì)性上升或下降失控。為了彌補(bǔ)這一不足，我們?cè)跈z測(cè)20個(gè)點(diǎn)之后，計(jì)算出中心線和控制線，轉(zhuǎn)入L-J法繪制質(zhì)控圖，使實(shí)驗(yàn)室工作人員能及時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的失控情況，并能一目了然的判斷質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)出現(xiàn)上升或下降等趨勢(shì)性變化，及時(shí)發(fā)現(xiàn)一些即刻法仍在控，而Levery-Jenning圖可能已處于警告或失控范圍的情況。

質(zhì)控方法建立離不開(kāi)持續(xù)性的改進(jìn)：⑴“即刻法”只要3次檢測(cè)結(jié)果就可開(kāi)始質(zhì)控，所以前3次的檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。據(jù)計(jì)算表明，若前3次檢測(cè)結(jié)果允許的CV在5%以內(nèi)時(shí)，第4個(gè)檢測(cè)結(jié)果CV值>16%即失控；若前3次檢測(cè)結(jié)果允許的CV>15%時(shí)，第4個(gè)檢測(cè)結(jié)果CV值>40%遠(yuǎn)超室內(nèi)質(zhì)控允許的范圍（≤30%）[11，12]。在本研究中IL-10前三點(diǎn)的CV值為7.72%，這有可能導(dǎo)致即刻法未能及時(shí)檢出第13點(diǎn)警告值。因此在后續(xù)的檢測(cè)中我們認(rèn)為應(yīng)重復(fù)前三次檢測(cè)，將測(cè)定結(jié)果>均值+2SD或＜均值-2SD的數(shù)據(jù)剔除，以保證前3次結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度；⑵由于CBA法操作過(guò)程繁瑣，從樣本處理、上機(jī)檢測(cè)到數(shù)據(jù)處理都對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求較高，每一步操作出現(xiàn)失誤都會(huì)影響到結(jié)果[6]。因此實(shí)驗(yàn)前期我們建立了細(xì)胞因子測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP)，定期校準(zhǔn)專用的加樣槍，每次測(cè)定前都對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)，盡量保證了每次實(shí)驗(yàn)條件的一致性。但臨床工作中仍然發(fā)現(xiàn)有操作過(guò)程不規(guī)范，對(duì)質(zhì)控方法理解不到位等情況，因此加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的操作培訓(xùn),提高工作人員對(duì)即刻法質(zhì)控的理解，也是預(yù)防性質(zhì)控必不可少的一環(huán)。

綜上所述，我們認(rèn)為以“即刻法”可基本滿足CBA法檢測(cè)細(xì)胞因子的初始數(shù)據(jù)監(jiān)控，在數(shù)據(jù)滿20次后結(jié)合L-J圖,可建立一個(gè)全面的質(zhì)量管理體系,能確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。