茹彥海，徐家云，趙富利

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.腎臟內(nèi)科；2.全科醫(yī)學(xué)科，河南 洛陽(yáng) 471000）

特發(fā)性膜性腎病（IMN）是成人原發(fā)性腎小球疾病的常見(jiàn)病理類型之一，患者的臨床表現(xiàn)各異，預(yù)后差異很大，某些情況下可以自行緩解，近一半的患者最終進(jìn)入慢性腎功能衰竭[1,2]。血栓形成的發(fā)生是腎病綜合征的嚴(yán)重并發(fā)癥，并且是影響患者預(yù)后和療效的最危險(xiǎn)因素[3]。目前IMN患者血栓栓塞的機(jī)制研究較少。IMN的診斷主要基于腎臟穿刺的病理活檢，但腎穿刺活檢通常具有某些禁忌癥和并發(fā)癥[4]?？筂型磷脂酶A2受體（PLA2R）抗體于2009年被BEcK等人在成人IMN患者的血液中發(fā)現(xiàn)，其水平與患者蛋白尿的增加和減少有關(guān)，可能是重要的IMN的靶抗原[5]。但是抗PLA2R抗體是否為IMN的致病性自身抗體目前尚不清楚。為了探討血清PLA2R抗體與IMN血栓易感狀態(tài)的關(guān)系本研究選取我院收治的86例IMN患者進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 資料 選取我院收治的86例特發(fā)性膜性腎病患者作為研究對(duì)象，檢測(cè)兩組的血清抗PLA2R抗體，分為抗PLA2R抗體陽(yáng)性患者40例（陽(yáng)性組）、抗PLA2R抗體陰性患者46例（陰性組），患者收集時(shí)間2019年9月至2021年6月。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴特發(fā)性膜性腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《內(nèi)科學(xué)》第七版中的標(biāo)準(zhǔn)[6]；⑵患者臨床表現(xiàn)為腎病綜合征或蛋白尿、血尿等；⑶實(shí)驗(yàn)室檢查患者24h尿蛋白定量≥3.5g，血漿白蛋白＜30.0g/L，患者伴有高脂血癥、水腫；⑷患者經(jīng)過(guò)腎臟穿刺病理學(xué)檢查確診，病理分期參照Ehrenreich標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅲ期；⑸本研究符合醫(yī)學(xué)倫理相關(guān)要求，對(duì)涉及患者隱私的相關(guān)資料保密。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴繼發(fā)性膜性腎?。庖呦到y(tǒng)疾病、感染性或寄生蟲(chóng)相關(guān)疾病、藥物或毒素因素）；⑵精神疾病、阿爾茨海默??；⑶惡性腫瘤；⑷腎結(jié)核；⑸腎移植、IgA腎病患者。

陽(yáng)性組，年齡29～72歲，平均47.0±11.9歲，男26例、女14例；Ehrenreich標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期12例、Ⅱ期22例、Ⅲ期6例；患者體質(zhì)量22.9±2.2kg/m2；收縮壓（SBP）/舒 張 壓（DBP）121.0±7.9/73.0±6.0mmHg。陰性組，年齡27～69歲，平均46.3±9.5歲，男26例、女20例；Ehrenreich標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期14例、Ⅱ期26例、Ⅲ期6例；患者體質(zhì)量22.7±2.4kg/m2；SBP/DBP 123.1±8.4/71.8±7.4mmHg。兩組患者的年齡、性別等上述基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 抗PLA2R抗體檢測(cè) 使用歐蒙公司抗磷脂酶A2受體抗體IgG檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法)檢測(cè)，采集患者的肘部靜脈血5ml，1000r/min離心10min，取上清液待測(cè)。密封袋中取出實(shí)驗(yàn)板條，空白孔中加入樣品或者稀釋液(1：100稀釋)100μl/孔，檢測(cè)孔中加入標(biāo)本100μl/孔，膠紙封閉實(shí)驗(yàn)表?xiàng)l孔，36℃條件下孵育60～90min，磷酸鹽緩沖液清洗5次，空白對(duì)照孔中加入生物素抗體稀釋液100μl，檢測(cè)孔中加入生物素抗體檢測(cè)液100μl，膠紙封閉實(shí)驗(yàn)表?xiàng)l孔，36℃條件下孵育30～60min，空白對(duì)照孔中加入酶結(jié)合稀釋液100μl，檢測(cè)孔中加入酶結(jié)合檢測(cè)液100μl，膠紙封閉實(shí)驗(yàn)表?xiàng)l孔，磷酸鹽緩沖液清洗5次，加入TMB顯色底液（品牌：YSRIBIO湖州英創(chuàng)生物科技公司），避光36℃孵育15min，加入終止液100μl，3min內(nèi)檢測(cè)OD450值，BioTek酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2.2 凝血功能檢測(cè) 抽取患者3ml空腹靜脈血，加入濃度為129mmol/L檸檬酸鈉抗凝管中并混合，在3000r/min下離心10min分離血漿，冷凍保存于-20℃，用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)所有血漿D-二聚體（DD），凝血酶原時(shí)間（PT），活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT），纖維蛋白原（Fig）和凝血酶時(shí)間（TT）。

1.2.3 TEG檢測(cè) 采用TEG檢測(cè)兩組患者的血樣開(kāi)始檢測(cè)到初始血凝塊形成所需時(shí)間（R值）、初始血凝塊形成到達(dá)一定強(qiáng)度所需時(shí)間（K值）；纖維蛋白凝塊形成及加固的速率（Angle角）；主要反應(yīng)血小板的功能和數(shù)量（Ma值）、凝血指數(shù)（CI）、Ma值確定后30s纖維蛋白的溶解率（LY30）。

1.2.4 腎功能檢測(cè) 主要檢測(cè)兩組的24h尿蛋白定量、血肌酐（Scr）、尿酸（UA）、血漿白蛋白（ALB）。用溴甲酚紫法檢測(cè)患者的ALB，用酶法（CHOD-PAP法）檢測(cè)UA，用苦味酸法檢測(cè)Scr，用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白，試劑盒由上海紀(jì)寧生物科技有限公司提供，相應(yīng)步驟根據(jù)對(duì)應(yīng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0軟件，兩組患者年齡、24h尿蛋白定量、Scr、血漿ALB等計(jì)量數(shù)據(jù)采用（）表示，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)；性別等計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性組和陰性組的腎功能比較 陽(yáng)性組患者的24h尿蛋白定量、Scr、血漿ALB高于陰性組（P<0.05）；陽(yáng)性組和陰性組的UA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)性組和陰性組的腎功能比較（）

表1 陽(yáng)性組和陰性組的腎功能比較（）

組別n Scr（μmol/L）UA（mmol/L）陽(yáng)性組陰性組t值P值40 46 24h尿蛋白（g/24h）5.71±1.20 3.26±0.78 11.364 0.000 84.3±17.6 69.2±13.0 4.562 0.000 381.8±97.5 364.5±88.0 0.865 0.390 ALB（g/L）27.41±3.30 30.02±3.85-3.349 0.001

2.2 陽(yáng)性組和陰性組的凝血功能指標(biāo)比較 陽(yáng)性組患者的血漿D-D測(cè)定值高于陰性組（P<0.05）；陽(yáng)性組和陰性組的PT、APTT、Fig、TT測(cè)定值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 陽(yáng)性組和陰性組的凝血功能指標(biāo)比較（）

表2 陽(yáng)性組和陰性組的凝血功能指標(biāo)比較（）

組別 n D-D（mg/L） PT（s） APTT（s） Fg（g/L） TT（s）陽(yáng)性組陰性組t值P值40 46 0.34±0.11 0.17±0.10 7.506 0.000 12.61±1.04 12.40±0.84 1.035 0.303 28.51±3.30 29.04±2.75-0.812 0.419 4.10±0.81 3.82±0.72 1.697 0.093 16.48±1.73 16.20±1.55 0.792 0.431

2.3 陽(yáng)性組和陰性組的TEG參數(shù)比較 陽(yáng)性組患者的CI值、LY30測(cè)定值高于陰性組（P<0.05），陽(yáng)性組的R值低于陰性組（P<0.05），陽(yáng)性組和陰性組的K值、Angle角、Ma值、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

表3 陽(yáng)性組和陰性組的TEG參數(shù)比較（）

表3 陽(yáng)性組和陰性組的TEG參數(shù)比較（）

組別 n R值（min） K值（min） Angle角（°） Ma值（mm）陽(yáng)性組陰性組t值P值40 46 4.88±1.20 5.68±1.17-3.125 0.002 1.46±0.34 1.53±0.31-0.998 0.321 70.52±6.61 68.27±5.59 1.710 0.091 62.81±5.77 64.03±5.59-0.995 0.323 CI 1.33±0.38 1.04±0.32 3.842 0.000 LY30（%）0.38±0.11 0.19±0.09 8.807 0.000

3 討論

IMN是成人慢性腎臟疾病的主要原因之一，是抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，患者腎小球內(nèi)臟層中免疫復(fù)合物逐漸沉積，導(dǎo)致基底膜彌漫性增厚,多達(dá)40%至50%的患者在15年內(nèi)會(huì)發(fā)展為終末期腎臟疾病[7,8]。在IMN分子發(fā)病機(jī)制中足細(xì)胞自身抗原的鑒定方面已取得重要進(jìn)展。PLA2R是存在于人腎小球足細(xì)胞膜上的跨膜糖蛋白，與相應(yīng)的蛋白質(zhì)形成免疫復(fù)合物，沉積在腎小球上以進(jìn)一步激活補(bǔ)體形成，從而導(dǎo)致足細(xì)胞疾病[9]。血栓形成的發(fā)生與許多因素有關(guān)，通常與血液粘度，血流緩慢和血管內(nèi)皮損傷有關(guān)。在先前的臨床研究中，IMN中血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是低蛋白血癥，蛋白尿和其他指標(biāo)[10]。

相關(guān)研究表明[11],與24h尿蛋白相比,PLA 2R抗體水平是更好的尿液活動(dòng)指標(biāo)，可以及時(shí)響應(yīng)疾病活動(dòng)。血清PLA2R抗體陽(yáng)性患者的蛋白尿和低白蛋白血癥更為嚴(yán)重。本次研究結(jié)果顯示陽(yáng)性組患者的24h尿蛋白定量、Scr、血漿ALB明顯高于陰性組。提示IMN患者血清中PLA2R抗體的表達(dá)與患者白蛋白和尿蛋白之間存在一定的相關(guān)性。主要原因是當(dāng)PLA2R與抗體結(jié)合時(shí)，形成的免疫復(fù)合物積聚在腎小球基底膜上。隨著臨床分期加重，血清腎功能指標(biāo)的增加也表明腎功能嚴(yán)重受損。

血栓形成與外科手術(shù)創(chuàng)傷，血管內(nèi)出血引起的血管內(nèi)皮損傷和凝血病密切相關(guān)[12]。PT，APTT，F(xiàn)g和TT是臨床凝血功能判斷的常規(guī)測(cè)量項(xiàng)目，是在手術(shù)前篩查異常凝血功能的強(qiáng)制性項(xiàng)目，在臨床疾病的診斷和治療中具有重要價(jià)值[13]。本次研究結(jié)果顯示，陽(yáng)性組患者的血漿D-D測(cè)定值明顯高于陰性組，PT、APTT、Fg、TT測(cè)定值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于陽(yáng)性組患者的止血時(shí)間延長(zhǎng)，凝血功能紊亂。

常規(guī)的凝血項(xiàng)目只能檢測(cè)到凝血過(guò)程的某個(gè)階段或某個(gè)組成部分，靈敏度較低，只能單方面反映凝血功能的變化[14]。 研究表明[15,16]，當(dāng)凝血因子降低至正常值的30%至50%時(shí)，凝血酶原時(shí)間和活化的部分凝血活酶時(shí)間會(huì)明顯改變。血栓彈力描記術(shù)（TEG）可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)全血凝結(jié)的全過(guò)程，是及時(shí)檢測(cè)血液高凝性的有效和可靠的指標(biāo)之一[17]。R值反映了凝血因子參與凝血起始階段的作用。MA值主要反映血小板的聚集功能，其大小受纖維蛋白原和血小板的影響，MA值增加表明血小板聚集增加和血小板功能亢進(jìn)。LY30反映了纖溶功能;CI可以確定凝血和出血的綜合狀態(tài)[18]。本次研究中，陽(yáng)性組患者的CI值、LY30測(cè)定值明顯高于陰性組，陽(yáng)性組的R值明顯低于陰性組，其原因是陽(yáng)性組中凝血因子的數(shù)目顯著增加或者凝血功能增強(qiáng)，并且主要是內(nèi)源性凝血因子。由于血小板在靜脈血栓形成中不發(fā)揮主要作用，因此它們僅發(fā)揮其功能的一部分。在這項(xiàng)研究中，陽(yáng)性組和陰性組的Ma值均無(wú)顯著變化，表明患者血小板的數(shù)量和功能沒(méi)有顯著變化。

以往研究[19,20]中對(duì)IMN的研究主要集中于對(duì)抗PLA2R抗體陽(yáng)性和陰性表現(xiàn)患者腎功能指標(biāo)的研究，顯示IMN患者伴有明顯的腎功能不全?；诖耍狙芯吭黾恿藢?duì)凝血相關(guān)指標(biāo)的研究，并且應(yīng)用TEG檢測(cè)，通過(guò)血小板數(shù)量，功能和纖維蛋白溶解的變化來(lái)反映凝血功能。結(jié)果表明在血液循環(huán)中血循環(huán)中抗PLA2R抗體陽(yáng)性的IMN患者與具有陰性抗體的患者相比，血栓形成的發(fā)生率更高。

綜上所述，抗PLA2R抗體陽(yáng)性IMN患者的凝血相關(guān)指標(biāo)與抗PLA2R抗體陰性患者存在顯著差異，其發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)增高。