趙晨，王倩

（息縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 信陽(yáng) 464300）

氣道慢性炎癥是變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）的重要病理學(xué)改變，若這種慢性炎癥得不到有效控制，可導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性（Airway Hyper Reactivity，AHR），使氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[1,2]。AHR主要因氣道受到刺激,多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與，損傷氣道上皮而發(fā)生，對(duì)哮喘患兒生命健康構(gòu)成威脅[3]。明確CVA患兒的AHR情況，是指導(dǎo)治療合理展開的關(guān)鍵，但目前對(duì)于AHR的早期評(píng)估相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一,且既往常用肺功能儀測(cè)定評(píng)估方法也有局限，如重度患兒配合度不佳、咳嗽劇烈等均會(huì)影響檢查結(jié)果,因此還需要尋找新的標(biāo)志物幫助CVA患兒早期AHR評(píng)估。嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophil，EOS）屬于白細(xì)胞的一種，是強(qiáng)效前炎癥細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)釋放多種毒性蛋白及炎性介質(zhì),可致氣道上皮損傷,介導(dǎo)AHR的病理進(jìn)程[4]。白細(xì)胞介素-5（Interleukin-5，IL-5）是由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，可特異性作用于EOS，引起EOS黏附及趨化，進(jìn)而損傷氣道上皮，導(dǎo)致AHR[5]。由此推測(cè)IL-5、EOS可能與CVA患兒AHR存在一定聯(lián)系，但目前關(guān)于此類的研究較少，基于此，本研究主要觀察誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS在CVA患兒中的表達(dá)情況，并分析IL-5、EOS與AHR的關(guān)系。旨在指導(dǎo)未來(lái)CVA患兒AHR評(píng)估與治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意后,前瞻納入醫(yī)院2018年2月-2020年3月符合條件的83例CVA患兒為研究對(duì)象，患兒家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情，簽署研究知情同意書。83例患兒中男49例,女34例；年齡5～14歲,平均年齡8.78±1.20歲；體質(zhì)量13.5～49kg，平均25.34±2.03kg；哮喘程度[6]：輕度48例、中重度35例；家族史29例。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)⑴符合《兒童咳嗽變異性哮喘診治》[7]中CVA診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)X線片、肺通氣功能及實(shí)驗(yàn)室檢查確診；⑵患兒主要癥狀為咳嗽，咳嗽時(shí)間超過(guò)4周；⑶患兒依從性好，可配合完成本次研究；⑷每位患兒均有一位主要照顧者配合本次調(diào)查研究，且照顧者精神正常。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴入組近2周服用過(guò)激素類、支氣管舒張劑類等對(duì)檢查可能有影響的藥物；⑵合并肺間質(zhì)性疾病患兒；⑶喘息癥狀無(wú)法緩解，難以耐受肺部相關(guān)檢查；⑷合并骨肉瘤、白血病等良、惡性腫瘤；⑸合并免疫系統(tǒng)疾病。

1.3 方法

1.3.1 CVA患兒AHR檢測(cè)及分組方法[8]肺功能儀選擇MasterScreen IOS（德國(guó)Jaeger公司），首先測(cè)定吸入生理鹽水2min后第一秒用力呼氣容積（Forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）作為基礎(chǔ)對(duì)照值，然后吸入不同劑量組胺，分別為：0.01、0.02、0.04、0.16、0.26、0.68、1.27mg,不同劑量吸入2min后測(cè)定FEV1值，后再吸入下一劑量，直至測(cè)得FEV1較基礎(chǔ)值下降≥20%或達(dá)最高累計(jì)劑量2.44mg結(jié)束；若FEV1較基礎(chǔ)值下降≥20%且未進(jìn)行最后一步則為試驗(yàn)陽(yáng)性；若患兒吸入藥物達(dá)最大量，F(xiàn)EV1下降＜15%則為試驗(yàn)陰性；以FEV1下降20%的最低組胺累積劑量評(píng)估AHR嚴(yán)重程度，若累積劑量為0.25～2.20mg為輕度；設(shè)為輕度組；若累積劑量＜0.25mg為中重度；設(shè)為中重度組。

1.3.2 CVA患兒誘導(dǎo)痰中IL-10、IL-5、EOS表達(dá)主要指標(biāo)檢測(cè)方法 ⑴CVA患兒誘導(dǎo)痰中IL-10、IL-5檢測(cè)方法：入院時(shí)，清潔患兒口腔及咽部，預(yù)防性吸入200μg沙丁胺醇，超聲霧化吸入3%高滲鹽水7min，誘導(dǎo)咳痰，將采集的痰液置于無(wú)菌收集器，痰量為1ml，每低倍鏡視野內(nèi)鱗狀上皮細(xì)胞/有核細(xì)胞＜20%為合格痰液,向合格標(biāo)本中加入等體積1%二硫蘇糖醇溶痰，混合均勻，3000r/min離心100min（由常州普天儀器制造有限公司提供的G16-X型離心機(jī)）,取上清液，保存待檢；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-5、IL-10水平；試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；操作嚴(yán)格遵照說(shuō)明書進(jìn)行；⑵CVA患兒誘導(dǎo)痰中EOS表達(dá)檢測(cè)方法：誘導(dǎo)咳痰、合格標(biāo)本選取及鑒定方法均同IL-10、IL-5檢測(cè),向合格標(biāo)本中加入等體積1%二硫蘇糖醇溶痰，混合均勻，3000r/min離心10min,棄上清液棄上清液，沉淀涂片，固定，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,于光鏡下進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分類,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及EOS占比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以%和n表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)；全部計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用“”表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中分位數(shù)間距[M（P25～P75）]表示,兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);經(jīng)Logistic回歸分析檢驗(yàn)各主要標(biāo)志物對(duì)CVA患兒AHR的影響；繪制受試者工作曲線（ROC），并計(jì)算曲線下面積（AUC）值，以檢驗(yàn)IL-5、EOS表達(dá)預(yù)測(cè)CVA患兒中重度AHR的價(jià)值，AUC值＞0.9表示預(yù)測(cè)性能較高，0.70～0.90表示有一定預(yù)測(cè)性能,0.5-0.7表示預(yù)測(cè)性能較差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CVA患兒AHR及分組情況83例CVA患兒經(jīng)評(píng)估結(jié)果顯示，有20例患兒為AHR中重度，占24.10%（20/83）,63例患兒為AHR輕度,占75.90%（63/83）。

2.2 兩組患兒基線資料比較 兩組患兒基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中重度組患兒誘導(dǎo)痰中IL-10表達(dá)低于輕度組，IL-5、EOS表達(dá)高于輕度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患兒基線資料比較

2.3 各主要指標(biāo)與CVA患兒AHR關(guān)系的回歸分析 將2.2中比較差異有意義的變量納入作為自變量,將CVA患兒AHR程度作為因變量（1=中重度，0=輕度），經(jīng)二元Logistic回歸分析檢驗(yàn)后，將2.2中全部資料納入，建立多元回歸模型，結(jié)果顯示，IL-10、IL-5、EOS異常表達(dá)均與CVA患兒AHR程度有關(guān)，IL-10低表達(dá)及IL-5、EOS過(guò)表達(dá)均可能是CVA患兒中重度AHR的風(fēng)險(xiǎn)因子（OR＞1，P＜0.05）。見表2。

表2 各主要指標(biāo)與CVA患兒AHR關(guān)系的回歸分析結(jié)果

2.4 誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS表達(dá)單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)CVA患兒AHR程度的價(jià)值分析 將CVA患兒AHR程度作為狀態(tài)變量（1=中重度，0=輕度），并將IL-5、EOS表達(dá)作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC曲線圖（見圖1），結(jié)果顯示,當(dāng)誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS的cutoff值分別取149.160pg/ml、15.305%時(shí),提示CVA患兒中重度AHR高風(fēng)險(xiǎn),且此時(shí)IL-5、EOS單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)CVA患兒中重度AHR的AUC分別為0.861、0.881、0.903，均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。見表3。

圖1 誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS表達(dá)單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)CVA患兒AHR程度價(jià)值的ROC曲線圖

表3 誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS表達(dá)單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)CVA患兒AHR程度的價(jià)值分析結(jié)果

3 討論

兒童慢性咳嗽病因較復(fù)雜,其中CVA是常見病因,研究表明，中國(guó)兒童慢性咳嗽的病因構(gòu)成中，CVA居首位[9]。CVA通常被認(rèn)為是哮喘前期表現(xiàn)，若得不到及時(shí)有效控制，可發(fā)展為哮喘[10]。氣道炎癥及氣道重塑是CVA重要病理學(xué)改變,可導(dǎo)致AHR，改變患兒氣道結(jié)構(gòu)，不利于預(yù)后[11]。2014年，于興梅等[12]研究報(bào)道稱，CVA患兒多伴不同程度AHR，初診時(shí)中重度AHR占23.5%。本研究中，83例CVA患兒經(jīng)評(píng)估,20例為AHR中重度,占24.10%,與上述研究結(jié)果相似，可見CVA患兒AHR程度嚴(yán)重，早期評(píng)估與干預(yù)尤為關(guān)鍵。

近年臨床多關(guān)注兒童哮喘的病理生理機(jī)制,發(fā)現(xiàn)相關(guān)細(xì)胞因子、促炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子等均參與氣道重塑及炎癥病理過(guò)程,可反映機(jī)體呼吸道纖維化程度[13]。IL-10是一種效應(yīng)細(xì)胞因子，是炎癥-免疫的下行調(diào)節(jié)因子,與哮喘的發(fā)生及發(fā)展具有密切聯(lián)系，可抑制相關(guān)促炎癥細(xì)胞因子生成[14]。據(jù)報(bào)道，在哮喘病理過(guò)程中，IL-10可作用于抗原提呈細(xì)胞，影響Th2細(xì)胞活化，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞功能，進(jìn)而發(fā)揮一定抗炎作用[15]。推測(cè)IL-10可能與CVA患兒AHR存在一定聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn),中重度組患兒誘導(dǎo)痰中IL-10表達(dá)低于輕度組,且經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，IL-10可能與CVA患兒AHR程度有關(guān)，IL-10低表達(dá)可能預(yù)示著CVA患兒AHR程度較嚴(yán)重。但需注意的是，誘導(dǎo)痰中IL-10對(duì)CVA患兒AHR程度影響的OR風(fēng)險(xiǎn)值不及IL-5、EOS，指標(biāo)穩(wěn)定性欠佳，具體結(jié)論尚待證實(shí)。

EOS是一種炎性細(xì)胞，EOS活化可分泌大量具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性作用的活性物質(zhì),其中EOS陽(yáng)離子蛋白可導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞損傷,改變黏膜通透性，誘導(dǎo)組胺釋放，進(jìn)而產(chǎn)生通氣障礙及呼吸道高反應(yīng)性[16]。研究顯示，CVA患者誘導(dǎo)痰中EOS表達(dá)升高，病情進(jìn)展及咳嗽癥狀加重，進(jìn)一步破壞支氣管壁，增加AHR程度[17]。IL-5主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，生物學(xué)活性相對(duì)較窄，是主要調(diào)節(jié)EOS生長(zhǎng)及分化的活性細(xì)胞因子[18]。據(jù)報(bào)道，IL-5可促進(jìn)EOS聚集、活化及分化等過(guò)程,維持并延長(zhǎng)成熟EOS生存期，具有較強(qiáng)趨化活性，可誘導(dǎo)EOS氣道內(nèi)浸潤(rùn)，進(jìn)而引起AHR[19]。由此推測(cè)IL-5與、EOS與CVA患兒AHR有一定聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，中重度組患兒誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS表達(dá)高于輕度組,經(jīng)多元回歸分析結(jié)果顯示，IL-5、EOS異常表達(dá)可能與CVA患兒AHR程度有關(guān)，二者過(guò)表達(dá)可能提示中重度AHR，也可能是二者的過(guò)表達(dá)參與了AHR的進(jìn)展。分析其原因可能為，EOS在肺組織中浸潤(rùn)是哮喘重要病理特征，EOS活化分泌大量活性物質(zhì)，產(chǎn)生一定細(xì)胞毒性，可引起支氣管上皮細(xì)胞脫落及損傷，且活化T淋巴細(xì)胞的IL-5使EOS增增殖及活化，釋放多種炎性介質(zhì)，進(jìn)而引起AHR，且EOR表達(dá)越高，細(xì)胞毒性越強(qiáng)，對(duì)氣道上皮造成損傷越大，則AHR越重[20]。而IL-5是調(diào)節(jié)EOS功能的重要細(xì)胞因子，可促進(jìn)EOS活化及增殖等，趨化活性強(qiáng)，可進(jìn)一步誘導(dǎo)EOS向氣道內(nèi)浸潤(rùn)[21]。本研究繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，IL-5、EOS單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)CVA患兒AHR程度重均有一定價(jià)值,且當(dāng)二者的cut-off值分別取149.160pg/ml、15.305%時(shí),可獲得最佳預(yù)測(cè)價(jià)值,提示早期監(jiān)測(cè)IL-5、EOS表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)CVA患兒AHR程度有一定價(jià)值,未來(lái)可考慮為患者早期動(dòng)態(tài)檢測(cè)誘導(dǎo)痰IL-5、EOS表達(dá),以指導(dǎo)AHR程度評(píng)估及合理治療,可能對(duì)提高CVA的治療效果有積極意義。但本研究未對(duì)誘導(dǎo)痰IL-5、EOS表達(dá)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果仍存在局限，具體結(jié)論仍需日后臨床進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，CVA患兒入院時(shí)誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS表達(dá)與AHR有一定關(guān)系，二者過(guò)表達(dá)可能提示中重度AHR風(fēng)險(xiǎn),考慮早期可通過(guò)監(jiān)測(cè)CVA患兒誘導(dǎo)痰中IL-5、EOS表達(dá)以評(píng)估其AHR程度，并指導(dǎo)治療。