王文娟，胡志堅(jiān)，何巍巍，歐陽良良，梁曉君

（九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江 332000）

艱難梭菌 （Clostridium difficile,C.difficile）屬革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，在自然環(huán)境中廣泛存在；是醫(yī)院內(nèi)抗生素相關(guān)感染性腹瀉的主要病因。在腸道定植的艱難梭菌可產(chǎn)生兩種外毒素，毒素A和B。毒素可導(dǎo)致急性炎癥、細(xì)胞壞死和腸道液體分泌[1-3]。近年來，在美國由艱難梭菌感染導(dǎo)致的死亡率增長迅猛[4]。通常情況下，只有當(dāng)腸道正常菌群被破壞后，比如使用抗生素治療其他疾病的過程中，艱難梭菌才會(huì)造成感染發(fā)病[5,6]。因此，艱難梭菌感染已成為住院病人高發(fā)傳染病。而抗生素治療對(duì)艱難梭菌感染大多無效[7]。目前，治療艱難梭菌相關(guān)疾?。–lostridium difficile-associated disease,CDAD）的方法是盡可能停用導(dǎo)致疾病發(fā)生的抗生素，輔助以萬古霉素或甲硝唑進(jìn)行治療。但治療方法無法重建腸道正常菌群對(duì)艱難梭菌感染的抑制，也無法阻止艱難梭菌芽孢的產(chǎn)生[8]。

CDAD在多種動(dòng)物模型中進(jìn)行研究，如倉鼠、豚鼠、無菌小鼠和大鼠等[9-12]。倉鼠是最常使用的動(dòng)物模型，經(jīng)抗生素處理之后，艱難梭菌可在倉鼠腸道定植并誘發(fā)CDAD。但倉鼠發(fā)病的主要部位在盲腸，動(dòng)物發(fā)病后會(huì)發(fā)展為腹瀉，并因急性炎癥而快速死亡。該模型可模擬快速發(fā)病并致死疾病類型，但與人體CDAD通常病程存在很多不同。實(shí)驗(yàn)室常用的正常狀態(tài)的小鼠和大鼠不易感染艱難梭菌，但艱難梭菌可以在無菌小鼠和大鼠的腸道定植并發(fā)展成假膜性結(jié)腸炎，且與人體感染更為類似[13-15]。但無菌小鼠或大鼠的獲取價(jià)格昂貴，并不適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用。

因此，本研究擬建立實(shí)驗(yàn)室常用小鼠感染艱難梭菌模型，為后續(xù)研究艱難梭菌感染及治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 艱難梭菌ATCC 43255購自美國模式菌種保藏中心ATCC（American Type Culture Collection）。BALB/c小鼠（雌，14～16g），購自江西省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。腦心浸液（干粉）購自BD公司 （BD Biosciences,237400），CCFA瓊 脂 基 礎(chǔ)（HB8808）和50%卵黃乳液（HB8295）購自青島海博生物技術(shù)有限公司，環(huán)絲氨酸（239831）和頭孢西丁鈉（C4786）購自Sigma公司。厭氧培養(yǎng)箱購自上?？等A生化儀器公司。氨芐西林（59349）、鏈霉素（1203008）、萬古霉素（V2002）購自Sigma公司。

1.2 動(dòng)物處理及感染BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，一組作為對(duì)照（不經(jīng)抗生素處理），另3組分別使用不同抗生素進(jìn)行處理。氨芐西林（0.5mg/ml）、鏈 霉 素（5mg/ml）及 萬 古 霉 素（0.1mg/ml）添加入小鼠飲水中，小鼠自由飲水，處理5天。

1.3 艱難梭菌培養(yǎng)及感染 將艱難梭菌ATCC 43255劃線接種于CCFA平板（CCFA瓊脂基礎(chǔ)10.6g，加水定容至200ml，高壓滅菌后加入50%卵黃乳液10 ml，環(huán)絲氨酸0.1g，頭孢西丁3.2mg），于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落接種于BHI培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。然后取培養(yǎng)液涂布于血平板，厭氧培養(yǎng)5天以促使艱難梭菌芽孢產(chǎn)生。用無菌PBS將菌苔沖洗下平板，65C孵育2小時(shí)。芽孢經(jīng)無菌PBS沖洗3次，經(jīng)連續(xù)稀釋后涂布CCFA平板，定量芽孢數(shù)目（以CFU計(jì)數(shù)）。

小鼠經(jīng)抗生素飲用水處理5天，隨即換普通飲水1天。然后經(jīng)口腔灌胃103 CFU艱難梭菌。剩余菌經(jīng)連續(xù)稀釋后涂板定量計(jì)數(shù)，以確定接種菌量準(zhǔn)確。

1.4 樣品采集和檢測(cè)指標(biāo) 感染后24h，收集艱難梭菌感染后小鼠的糞便樣本并稱重，用PBS溶解后逐級(jí)稀釋，取不同梯度稀釋液涂布于CCFA平板，厭氧培養(yǎng)，計(jì)數(shù)芽孢菌數(shù)量。觀察小鼠死亡情況，繪制艱難梭菌感染后小鼠的生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的抗生素處理及感染 我們選取了臨床上經(jīng)常使用的抗生素來破壞小鼠腸道正常菌群，觀察抗生素處理后小鼠對(duì)艱難梭菌的易感程度。將不同抗生素按如下濃度溶解于小鼠飲用水中，氨 芐 西 林0.5mg/ml，鏈 霉 素5mg/ml，萬 古 霉 素0.1mg/ml，小鼠自由飲水，處理5天。之后換成未添加抗生素的飲用水處理一天，隨后進(jìn)行艱難梭菌感染。

2.2 不同抗生素處理的小鼠感染艱難梭菌后細(xì)菌載量的變化 經(jīng)抗生素處理過的小鼠感染艱難梭菌24h后，取小鼠糞便，溶解于無菌PBS，經(jīng)連續(xù)逐級(jí)稀釋后，涂布于平板，計(jì)數(shù)小鼠糞便艱難梭菌數(shù)量。實(shí)驗(yàn)共計(jì)3次，計(jì)算菌落平均數(shù)。如圖1所示，鏈霉素處理后小鼠糞便中艱難梭菌含量最高，可達(dá)8.2107 CFU/g；氨芐西林處理的小鼠糞便中也可檢測(cè)到較高的艱難梭菌載量，可達(dá)1.5107 CFU/g；萬古霉素處理的小鼠糞便中檢測(cè)到的細(xì)菌載量很低，平均為3.6106 CFU/g。

圖1 不同抗生素處理小鼠感染艱難梭菌24h后糞便艱難梭菌載量（CFU/g）。ND，未檢測(cè)到。

2.3 不同抗生素處理的小鼠感染艱難梭菌后生存曲線 小鼠經(jīng)不同抗生素處理5天，換為正常飲水1天后，用103 CFU艱難梭菌芽孢進(jìn)行感染，每天觀察記錄動(dòng)物死亡狀況，繪制艱難梭菌感染后小鼠生存曲線。如圖2所示，經(jīng)鏈霉素處理的小鼠，從感染后第2天起即出現(xiàn)死亡，至感染后第6天全部小鼠均死亡；經(jīng)氨芐西林處理的小鼠，從感染后第3天出現(xiàn)死亡，至感染后第8天有60%的小鼠死亡；經(jīng)萬古霉素處理的小鼠，至感染后第8天有20%的小鼠死亡；未經(jīng)抗生素處理的小鼠，均存活。

圖2 不同抗生素處理的小鼠感染艱難梭菌后生存曲線

3 討論

艱難梭菌感染在發(fā)達(dá)國家越來越受重視，其發(fā)病率和死亡率在近些年來都在上升，美國每年由艱難梭菌導(dǎo)致的死亡病例多達(dá)14000例[16]；在國內(nèi)也引起越來越多關(guān)注。艱難梭菌感染往往發(fā)生在抗生素破壞腸道正常菌群后，因此，常規(guī)抗生素不能用來治療艱難梭菌感染。臨床成功使用腸道菌群移植的方法治療艱難梭菌感染，提示了腸道正常菌群在對(duì)抗艱難梭菌感染中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)室簡單、易用的艱難梭菌感染動(dòng)物模型的缺失是制約艱難梭菌深入研究的一個(gè)因素，因此，本研究擬建立艱難梭菌感染的小鼠模型。

以往研究發(fā)現(xiàn)使用頭孢哌酮、克林霉素、替加環(huán)素或多種抗生素聯(lián)合用藥處理C57BL/6小鼠，可增強(qiáng)其對(duì)艱難梭菌的易感性[17,18]。本文考察臨床常用的鏈霉素、氨芐西林和萬古霉素是否可破壞腸道正常菌群、提高小鼠對(duì)艱難梭菌的易感性。通過使用三種臨床常用的抗生素處理小鼠，破壞小鼠腸道正常菌群，觀察不同抗生素處理的小鼠對(duì)艱難梭菌的易感性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鏈霉素處理后的小鼠對(duì)艱難梭菌感染最易感，經(jīng)氨芐西林處理的小鼠易感性次之，經(jīng)萬古霉素處理的小鼠對(duì)艱難梭菌易感性較差，而未經(jīng)處理的小鼠對(duì)艱難梭菌不易感。成功建立的艱難梭菌感染小鼠動(dòng)物模型，為研究腸道菌群在對(duì)抗艱難梭菌感染中的作用及機(jī)制、艱難梭菌感染預(yù)防治療方案的評(píng)價(jià)等奠定了基礎(chǔ)。