韓俊壘，胡建平，邊紅芝

（河南省胸科醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450002）

結(jié)核病是一種傳染性疾病，在世界范圍內(nèi)均廣泛流行，對(duì)人類身體健康有著嚴(yán)重的負(fù)面影響，特別是在發(fā)展中國(guó)家，疾病帶來的影響更為明顯。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)核分枝桿菌在人群中潛伏性感染率約為1/3，我國(guó)國(guó)內(nèi)結(jié)核病的年新增病例數(shù)約為130萬(wàn)例，在全世界結(jié)核病患病總例數(shù)中占比約為14%，居第二位，可見我國(guó)結(jié)核病發(fā)病的嚴(yán)峻性[1]。目前，結(jié)核病的主要感染源依然是活動(dòng)性肺結(jié)核，故早期鑒別診斷活動(dòng)性肺結(jié)核與潛伏性肺結(jié)核對(duì)結(jié)核病的有效控制極為關(guān)鍵[2]。結(jié)核病主要的診斷方法包括血清學(xué)、細(xì)菌學(xué)與分子生物學(xué)三種，其中血清學(xué)診斷具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、無需借助精密儀器、可在基層醫(yī)院展開等諸多優(yōu)點(diǎn)，但其仍存在缺乏高效價(jià)特異性抗原、靈敏度低等局限[3,4]。故越來越多的研究關(guān)注相關(guān)抗原蛋白融合表達(dá)或多種抗原聯(lián)合診斷在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。本研究基于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)員國(guó)家“十二五”專項(xiàng)研究，通過在國(guó)際上首次引入仿生親和免疫組學(xué)，篩選出4個(gè)候選蛋白T細(xì)胞新型標(biāo)志物（Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c），分析這些蛋白抗原用于輔助結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值，旨在為未來結(jié)核特異性T細(xì)胞檢測(cè)的臨床診斷及疫苗設(shè)計(jì)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 納入對(duì)象 選擇我院2016年12月-2018年12月河南省胸科醫(yī)院結(jié)核科與呼吸科接診的234例活動(dòng)性肺結(jié)核患者作為結(jié)核組；選擇同期我院接診的非結(jié)核病其他肺部疾病者128例作為其他肺部疾病組；選擇同期河南省中醫(yī)學(xué)院一附院接受常規(guī)體檢的110例健康人群作為健康組。結(jié)核組患者均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[5]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴有咳嗽、咯血、咳痰、發(fā)熱、納差、盜汗、疲倦、體重減輕、頭痛、胸痛、呼吸急促等結(jié)核病主要癥狀；⑵胸部CT或X線證實(shí)存在結(jié)核病變；⑶痰培養(yǎng)或涂片結(jié)果為陽(yáng)性；⑷支氣管鏡檢查確診；⑸PPD強(qiáng)陽(yáng)性；⑹抗結(jié)核治療有效；⑺病理確診。其他肺部疾病組患者有咳嗽、咳痰等表現(xiàn)，但均接受相應(yīng)檢查排除結(jié)核病或經(jīng)一段時(shí)間抗結(jié)核治療無效；健康組人群均經(jīng)全身體檢證實(shí)為健康人，無結(jié)合病史或其他肺部疾病史。排除：⑴合并血液系統(tǒng)疾病者、惡性腫瘤疾病者、免疫系統(tǒng)疾病者；⑵合并肝腎功能衰竭者；⑶合并精神疾病或心理障礙等無法很好的配合研究者。本次研究的設(shè)計(jì)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，且全部入選者及其家屬對(duì)此次研究設(shè)計(jì)的內(nèi)容均知情，并簽署知情同意書。

1.2 一般資料 結(jié)核組男性患者131例，女性患者103例；年齡38～65歲，平均（48.12±5.11）歲；體質(zhì)量44～75kg，平均（60.21±6.31）kg；受教育程度：75例小學(xué)及以下，109例初中或中專，50例高中及以上。其他肺部疾病組男性患者72例，女性患者56例；年齡40～65歲，平均（49.11±5.27）歲；體質(zhì)量45～74kg，平均（61.11±6.21）kg；受教育程度：41例小學(xué)及以下，60例初中或中專，27例高中及以上。健康組男性61例，女性49例；年齡36～65歲；平均（47.84±5.81）歲；體質(zhì)量45～75kg，平均（61.02±6.01）kg；受教育程度：35例小學(xué)及以下，51例初中或中專，24例高中及以上。3組納入者性別、年齡、體質(zhì)量、受教育程度等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑與材料 購(gòu)自上海奧普生物醫(yī)藥有限公司結(jié)核抗體檢測(cè)試劑盒，采用膠體金法。購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司的辣根過氧化物酶；北京科科躍中楷生物技術(shù)公司提供的化學(xué)發(fā)光底物液；北京索萊寶科技提供的吐溫-20 500mL，杭州四季青生物工程提供無支原體新生牛血清；中國(guó)醫(yī)藥公司提供碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀。

1.3.2 配制試劑 包括抗原包被液、磷酸鹽緩沖液、洗滌液、封閉液。

1.3.3 主要儀器SANYO提供的MCO-15AC型37°培養(yǎng)箱；北京東聯(lián)哈爾儀器提供的BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái)；德國(guó)BRAND提供的移液器；北京科美東雅提供的化學(xué)發(fā)光儀；北京拓普儀器提供的DEM-3型全自動(dòng)洗板機(jī)；德國(guó)eppendorf提供的5418xp811917型離心機(jī)。

1.3.4 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原的測(cè)定 嚴(yán)格按照各試劑盒操作要求，同時(shí)嚴(yán)格根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行相關(guān)的操作[6]。主要操作包括：篩選各抗原陽(yáng)性血清標(biāo)本、確定最佳酶標(biāo)二抗稀釋度、確定各抗原最佳包被濃度、采用化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法（CLEIA法）測(cè)定血清內(nèi)抗結(jié)核抗體、使用試劑盒測(cè)定血清內(nèi)抗結(jié)核抗體、涂片培養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，以表示計(jì)量資料，用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，以百分比表示計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)，繪制受試者工作曲線，以特異性為90%時(shí)的抗原水平發(fā)光值作為結(jié)核病診斷臨界值，計(jì)算各抗原的靈敏度與特異性，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人群血清各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較 經(jīng)化學(xué)發(fā)光酶免疫法測(cè)定血清結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c水平表達(dá)結(jié)果顯示，結(jié)核組患者各血清結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原水平表達(dá)最高，后由高至低依次為其他肺部疾病組、健康組，結(jié)核組與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其他肺部疾病組與健康組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組人群血清各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較（）

表1 3組人群血清各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較（）

注：a：與結(jié)核組比較，P＜0.05。

組別 Rv2041c（pg/ml） Rv1419（pg/ml） Rv2991（pg/ml） Rv3428c（pg/ml）結(jié)核組（n=234）其他肺部疾病組（n=128）健康組（n=110）FP 152714.36±25021.11 38421.02±4369.77a 36421.47±7761.42a 2372.197＜0.001 191712.79±28710.21 31201.31±4321.84a 25714.49±4601.24a 3740.966＜0.001 114910.96±9261.45 27510.56±2611.45a 24301.45±4114.17a 9637.433＜0.001 190310.46±21001.22 41621.22±7071.44a 37210.47±5000.12a 5761.978＜0.001

2.2 結(jié)核病組痰菌陰性與痰菌陽(yáng)性者各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較 全部234例結(jié)核組患者中,檢出痰菌陽(yáng)性者168例,占比為71.79%,其他66例均為痰菌陰性，陰性率為28.21%。痰菌陰性組與痰菌陽(yáng)性組各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 結(jié)核病組痰菌陰性與痰菌陽(yáng)性者各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較（）

表2 結(jié)核病組痰菌陰性與痰菌陽(yáng)性者各結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)比較（）

組別 Rv2041c（pg/ml） Rv1419（pg/ml） Rv2991（pg/ml） Rv3428c（pg/ml）痰菌陰性組（n=66）痰菌陽(yáng)性組（n=168）t P 141567.41±24125.37 146962.47±25241.45 1.490 0.138 184597.78±30214.56 190214.11±31457.89 1.243 0.215 109689.88±90145.69 121567.41±93021.44 0.887 0.376 185697.89±22457.15 192144.73±30001.21 1.580 0.116

2.3 4種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達(dá)在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的ROC曲線分析

2.3.1 Rv2041c在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標(biāo)、特異性作為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線（見圖1），以特異性為90%時(shí)Rv2041c發(fā)光值為69657.50作為結(jié)核病診斷陽(yáng)性臨界值，在全部234例結(jié)核病患者中，陽(yáng)性者165例，靈敏度為70.51%（165/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽(yáng)性者17例，特異度為86.72%（111/128）；110例健康組人群中，陽(yáng)性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度分別為86.97%。

圖1 Rv2041c檢測(cè)的ROC曲線圖

2.3.2 Rv1419在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標(biāo)、特異性作為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線（見圖2），以特異性為90%時(shí)Rv1419發(fā)光值為45650.50作為結(jié)核病診斷陽(yáng)性臨界值，在全部234例結(jié)核病患者中，陽(yáng)性者173例，靈敏度為73.93%（173/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽(yáng)性者22例，特異度為82.81%（106/128）；110例健康組人群中，陽(yáng)性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度為84.87%。

圖2 Rv1419檢測(cè)的ROC曲線圖

2.3.3 Rv2991在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標(biāo)、特異性作為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線（見圖3），以特異性為90%時(shí)Rv2991發(fā)光值為41250.50作為結(jié)核病診斷陽(yáng)性臨界值，在全部234例結(jié)核病患者中，陽(yáng)性者176例，靈敏度為75.21%（176/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽(yáng)性者17例，特異度為86.72%（111/128）；110例健康組人群中，陽(yáng)性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度為86.97%。

圖3 Rv2991檢測(cè)的ROC曲線圖

2.3.4 Rv3428c在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標(biāo)、特異性作為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線（見圖4），以特異性為90%時(shí)Rv3428c發(fā)光值為71569.50作為結(jié)核病診斷陽(yáng)性臨界值，在全部234例結(jié)核病患者中，陽(yáng)性者159例，靈敏度為67.95%（159/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽(yáng)性者15例，特異度為88.28%（113/128）；110例健康組人群中，陽(yáng)性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度為87.82%。

圖4 Rv3428c檢測(cè)的ROC曲線圖

3 討論

結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床實(shí)際中，標(biāo)本的涂片、鏡檢靈敏度較低[7,8]。血清結(jié)核抗體檢測(cè)具有標(biāo)本來源方便、操作簡(jiǎn)單方便、檢測(cè)結(jié)果快速等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛用于臨床，但靈敏度、特異度仍較低[9]。因此近幾年國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究將研究方向轉(zhuǎn)至蛋白抗原融合表達(dá)與多種蛋白抗原聯(lián)合檢測(cè)上。

Alito等[10]在2003年的研究結(jié)果指出，有接近90%的患者其血清內(nèi)存在至少1種結(jié)核抗體，且患者體內(nèi)抗體表達(dá)的種類、數(shù)量與水平可以隨著患者疾病不同階段、免疫背景與菌株的不同而有明顯區(qū)別。結(jié)核病抗體反應(yīng)針對(duì)的結(jié)合抗原是多種多樣的，任何抗原單獨(dú)檢測(cè)均無法完全測(cè)定結(jié)核病患者全部的血清結(jié)核抗體，故聯(lián)合檢測(cè)多種抗原，可以在確保特異性的基礎(chǔ)上幫助診斷敏感性提高[11,12]。本研究就主要的4種結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原（Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c）用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值進(jìn)行相關(guān)研究。

結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c基因（ID 887474）編碼蛋白質(zhì)主要由439個(gè)氨基酸殘基所組成，屬糖脂蛋白，主要由結(jié)核分枝桿菌H37Rv在體外缺氧、低pH的條件下高效表達(dá)產(chǎn)生[13,14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌Rv2041c可誘導(dǎo)結(jié)核病患者分泌高水平抗體，這與Garmory等[15]研究結(jié)果一致。本研究單獨(dú)將結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷，結(jié)果顯示，該蛋白測(cè)定結(jié)核抗體特異度為86.97%，有著較高的特異度，可見結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c是一種相對(duì)理想的結(jié)核病血清學(xué)診斷抗原。Rv1419是凝集素的一種，主要由結(jié)核分枝桿菌所分泌，是一種糖蛋白，僅在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)有表達(dá)，在其他的分枝桿菌中午表達(dá)[16-18]。Singh等[19]在2007年采用生物信息學(xué)鑒定并分析了分枝桿菌主要的11種凝集素，結(jié)果證實(shí)，Rv1419的分子量最小，該研究還證實(shí)了Rv1419會(huì)引起兔紅細(xì)胞的凝集，并對(duì)活性肺結(jié)核患者外周單核核細(xì)胞產(chǎn)生刺激，導(dǎo)致其γ-干擾素處于高水平；此外，該研究還在活動(dòng)性肺結(jié)核患者的外周血中檢測(cè)除了高滴度抗Rv1419 IgG抗體，而在給予患者合理的抗結(jié)核治療后，其對(duì)應(yīng)的抗體滴度降低?？梢奟v1419對(duì)結(jié)核病評(píng)價(jià)的重要意義。本研究所得結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，表明結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv1419可以刺激結(jié)核病患者抗體呈高水平狀態(tài)，該抗原用于結(jié)核病診斷的靈敏度與特異度均理想，可考慮將其用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷中。Rv2991與Rv3428c是近幾年新發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌重組抗原蛋白類型,前者已被證實(shí)用于結(jié)核病早期診斷有一定價(jià)值,且在特定的靈敏度下,其用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的特異度相對(duì)較高[20]。該結(jié)果與本研究所得結(jié)果一致。目前，與結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv3428c用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外均不多見,該蛋白抗原的相關(guān)機(jī)制、分子量等情況也尚未明確，本研究結(jié)果顯示，將Rv3428c蛋白抗原用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的特異度為87.82%，特異度較高，可以考慮將其與其他抗原蛋白聯(lián)合使用，以提高結(jié)核病早期鑒別診斷準(zhǔn)確率。但因上述結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原用于結(jié)核病早期血清學(xué)診斷相關(guān)循證學(xué)依據(jù)較少，故本研究中所得的結(jié)果與結(jié)論還應(yīng)在未來進(jìn)一步展開大樣本、長(zhǎng)時(shí)間的研究加以證實(shí)。

綜上所述,結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2 041c、Rv1419、Rv2991、Rv3428c輔助結(jié)核病的血清學(xué)診斷均有著較高的特異度，臨床實(shí)際中，可將各抗原聯(lián)合檢測(cè)，以提高抗結(jié)核抗體檢測(cè)敏感度，提高結(jié)核病的檢出率。