柏琳，于海濤，張金玲，施海濤，孫貴才

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院 大慶龍南醫(yī)院，黑龍江 大慶 163453； 2.南昌大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江西 南昌 330006)

慢性腎臟病(CKD)是一個(gè)全球性問(wèn)題，每年會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人死亡，而且據(jù)估計(jì)，每年約有32萬(wàn)的CKD患者會(huì)發(fā)展成終末期腎病(ESRD)。根據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)的研究報(bào)告，CKD是人類的三大疾病類死亡因素之一。研究表明，CKD與高血壓糖尿病肥胖和原發(fā)性腎臟疾病加速的年齡相關(guān)腎功能下降有關(guān)。足細(xì)胞是覆蓋腎小球基底膜外層的高度特異性上皮細(xì)胞，在許多人類腎臟疾病中受損。因此，足細(xì)胞是導(dǎo)致腎小球硬化蛋白性腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。N-甲基-d-天冬氨酸受體(NMDA受體)是受體門的非選擇性陽(yáng)離子通道，在腎臟的各種病理過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白6(TRPC6)是TRPC通道家族的成員。TRPC6突變及其表達(dá)和活性上調(diào)，與蛋白尿和足細(xì)胞丟失等導(dǎo)致CKD的原因有關(guān)。鑒于足細(xì)胞在CKD發(fā)展中的重要地位，有關(guān)NMDA受體與足細(xì)胞，及TRPC6與足細(xì)胞的調(diào)控關(guān)系已經(jīng)成為CKD病理的研究熱點(diǎn)。

黃芪多糖是黃芪的主要有效成分之一，具有提高免疫力、抗氧化和抗應(yīng)激等多種功效。大量研究表明，黃芪多糖可以用來(lái)治療慢性腎病，對(duì)糖尿病小鼠模型腎臟的超微結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[1-2]。有研究表明，高糖可以通過(guò)AngⅡ/TRPC6途徑介導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡[3]。本論文在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞的損傷可能是通過(guò)NMDA受體-ROS-TRPC6途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，本文以Ang Ⅱ誘導(dǎo)損傷的人足細(xì)胞為研究對(duì)象，基于NMDA受體-ROS-TRPC6途徑研究黃芪多糖對(duì)慢性腎病的治療機(jī)制，以期為黃芪多糖在CKD中的治療提供科學(xué)參考和新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人腎足細(xì)胞(BNCC340460)購(gòu)自北京北納生物公司。

1.2 主要試劑

黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品(89250-26-0)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)(35115-60-7)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;蛋白提取試劑盒(635626)、核酸提取試劑盒購(gòu)(9109)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR390A)和熒光定量PCR試劑盒(RR430A)購(gòu)自大連寶生物公司;MTT法檢測(cè)試劑盒(ab211091)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;人Calcineurin蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒(FU/R2080)和Nephrin蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京方程科技有限公司(FU-R2937)。

1.3 主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、倒置顯微鏡、熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)和酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組

足細(xì)胞分化足細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，以37 ℃，CO2濃度5%的條件下培養(yǎng)成熟后，在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期按如下方式對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行分組：(1)對(duì)照組按1∶ 1 000的比例在培養(yǎng)基中加入PRMI1640-培養(yǎng)液；(2)模型組按照1∶ 1 000比例在培養(yǎng)基中加入AngⅡ溶液；(3)給藥組按照1∶ 1 000比例在培養(yǎng)基加入AngⅡ溶液，同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入黃芪多糖溶液，使其終濃度為100 μmol/mL，實(shí)驗(yàn)期為24 h。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

(1)細(xì)胞活力檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用MTT法，具體步驟如下：分別取各組細(xì)胞，小心將原培養(yǎng)液吸走；用PBS緩沖液輕輕洗滌3次，然后加入等體積的新細(xì)胞培養(yǎng)液；每個(gè)孔分別加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)在37 ℃，CO2濃度5%的條件下對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)4 h；小心將每個(gè)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸走，終止培養(yǎng)；每孔分別加入DMSO溶液300 μL，在萬(wàn)向搖床上低速震蕩10 min；用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm的條件下，對(duì)空白孔和各樣品孔進(jìn)行檢測(cè)。

(2)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用熒光探針?lè)?，具體步驟如下：把Ca2+熒光檢測(cè)探針按比例稀釋；分別取各組細(xì)胞，將稀釋后溶液分別加入到待測(cè)孔中，在37 ℃，CO2濃度5%的條件下對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)20 min；按照5倍體積的比例向待測(cè)孔中加入FBS，在37 ℃，CO2濃度5%的條件下對(duì)足細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)40 min；小心吸走上層細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次；每個(gè)孔中加入胰蛋白酶溶液和HBSS溶液，將樣品制備成細(xì)胞懸液；用熒光檢測(cè)儀在激發(fā)光488 nm，發(fā)生光525 nm條件下，對(duì)空白孔和各樣品孔進(jìn)行檢測(cè)，然后收集各孔細(xì)胞，測(cè)定其總蛋白含量，并用總蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行校正。

(3)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用熒光探針?lè)?，具體步驟如下：按比例對(duì)活性氧探針進(jìn)行稀釋；分別取各組細(xì)胞，將活性氧探針的溶液200 μL加入到待測(cè)孔中；在37 ℃，CO2濃度5%的條件下對(duì)足細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)60 min；小心棄去上層培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次；用熒光倒置顯微鏡對(duì)ROS進(jìn)行觀察，并用熒光檢測(cè)儀在激發(fā)光488 nm，發(fā)生光525 nm的條件下，對(duì)空白孔和各樣品孔進(jìn)行檢測(cè)，然后收集各孔細(xì)胞，測(cè)定其總蛋白含量，并用總蛋白對(duì)ROS進(jìn)行校正。

(4)Calcineurin和Nephrin蛋白檢測(cè)。取各組細(xì)胞，將原培養(yǎng)液倒掉；按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總蛋白，ELISA的檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

(5)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。取各組細(xì)胞，將原有的培養(yǎng)液倒掉；按核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，對(duì)cDNA分裝后保持于-80 ℃冰箱待用。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的序列設(shè)計(jì)各基因引物，GAPDH為內(nèi)參，具體引物信息如下：

表1 引物信息

根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，對(duì)各待測(cè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黃芪多糖對(duì)足細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)Ca2+、ROS含量的影響

黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞的影響見(jiàn)表2。從表中可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激顯著降低了足細(xì)胞的活力(P<0.05)，而在AngⅡ刺激的同時(shí)給予黃芪多糖，足細(xì)胞活力雖然與對(duì)照組相比具有下降趨勢(shì)力(P>0.05)，但顯著高于模型組(P<0.05)。

黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量的變化見(jiàn)表2。從表中可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)Ca2+的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，黃芪多糖能顯著降低AngⅡ引起的足細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的升高(P<0.05)，但依然顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS的影響見(jiàn)表2和圖1。從表中可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS的含量增加(P<0.05)，在AngⅡ刺激的同時(shí)給予黃芪多糖，足細(xì)胞內(nèi)ROS的含量低于模型組(P<0.05)，但依然高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞活力、 細(xì)胞內(nèi)Ca2+、ROS含量的影響

圖1 黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

2.4 黃芪多糖對(duì)足細(xì)胞內(nèi)Calcineurin和Nephrin的影響

黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)Calcineurin和Nephrin的影響見(jiàn)表3。從圖中可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)Calcineurin的含量顯著增加(P<0.05)，Nephrin的含量顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，AngⅡ刺激的同時(shí)給予黃芪多糖，可以顯著降低足細(xì)胞內(nèi)Calcineurin的含量(P<0.05)，上調(diào)Nephrin的含量(P<0.05)，其中Calcineurin的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)Calcineurin和 Nephrin的影響

2.5 黃芪多糖對(duì)足細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的影響

黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的影響見(jiàn)表4。從表中可以看出，AngⅡ刺激后足細(xì)胞中的NR1和PI3K基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，TRPC6、Caspase-3的基因表達(dá)則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；同時(shí)給予黃芪多糖后，與模型組相比，足細(xì)胞中NR1的基因表達(dá)有增加趨勢(shì)(P>0.05)，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，PI3K基因表達(dá)則顯著提高(P<0.05)，TRPC6、Caspase-3的基因表達(dá)顯著降低(P<0.05)，其中TRPC6基因的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 黃芪多糖對(duì)AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi) 基因表達(dá)的影響

3 討論

目前，人們普遍認(rèn)為足細(xì)胞損傷不僅與蛋白尿的程度有關(guān)，而且與腎小球硬化癥的發(fā)展和腎功能的下降有關(guān)[4]。足細(xì)胞損傷是許多人類腎臟疾病的早期事件之一，包括微小改變病(MCD)、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)、糖尿病腎病(DKD)、膜性腎病(MN)，狼瘡性腎炎(LN)和其它CKD[5]。如果能在CKD早期對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，通常認(rèn)為可逆轉(zhuǎn)CKD的發(fā)展，至少治療方法要抑制腎臟中足細(xì)胞的丟失。

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用的一種補(bǔ)益類藥材，其入藥始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》。黃芪具有升陽(yáng)補(bǔ)氣、固表止汗、生津養(yǎng)血、托毒排膿等多種功效，在《圣濟(jì)總錄》中就有“補(bǔ)腎黃芪湯”的記載。黃巖龍等使用黃芪桂枝五物湯配合西醫(yī)方法，對(duì)慢性腎病患者進(jìn)行治療，取得了良好的效果[6]。黃海健等用黃芪益母湯治療慢性腎病可以顯著降低患者蛋白尿的排泄量[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃芪具有抗氧化、抑制炎性因子、抗菌等多種生物學(xué)活性[8]。黃芪的主要有效成分包括黃芪皂苷、黃芪多糖和黃芪黃酮等，其中黃芪多糖是由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖組成的復(fù)合物質(zhì)，具有抗氧化、抗應(yīng)激和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等生物學(xué)功能[9]。研究表明，黃芪多糖對(duì)缺血再灌注造成的大鼠腎損傷有保護(hù)作用[10]。

AngⅡ是造成腎臟發(fā)生局部損傷的效應(yīng)因子之一，可以介導(dǎo)足細(xì)胞的損傷[11]。大量研究表明，黃芪多糖可有效抑制AngⅡ?qū)π募≡斐傻膿p傷[12-14]。但黃芪多糖對(duì)AngⅡ造成的足細(xì)胞損傷的影響還鮮有報(bào)道。本研究中，黃芪多糖可以有效抑制AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞活性的影響，這說(shuō)明保護(hù)足細(xì)胞免受外界因素的刺激是黃芪多糖治療慢性腎病的機(jī)制之一。通過(guò)對(duì)足細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以顯著抑制Ang Ⅱ引起的足細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高。有研究指出，AngⅡ造成的足細(xì)胞損傷與Ca2+內(nèi)流顯著相關(guān)，在該過(guò)程中涉及了門通道蛋白NMDA受體和TRPC6的變化[15]。有研究表明，給小鼠注射AngⅡ誘發(fā)高血壓，可以上調(diào)NMDA受體亞基NR1的表達(dá)[16]。研究指出，NMDA受體中的NR1亞基參與了葉酸誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷，葉酸通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活了小鼠中的NMDA受體，使Ca2+大量進(jìn)入腎細(xì)胞，從而導(dǎo)致了ROS的產(chǎn)生[17]。有研究報(bào)道，在糖尿病腎病大鼠模型中，AngⅡ是以依賴TRPC通道的方式引起足細(xì)胞凋亡的[18]。TRPC6已經(jīng)成為足細(xì)胞是否發(fā)生損傷的決定因素，TRPC6可以介導(dǎo)足細(xì)胞中Ca2+流入的增加，并通過(guò)鈣依賴的途徑啟動(dòng)足細(xì)胞的程序性死亡。在本實(shí)驗(yàn)中，黃芪多糖對(duì)受到AngⅡ刺激的足細(xì)胞中NMDA受體亞基NR1的基因表達(dá)無(wú)顯著的抑制作用，卻能顯著抑制另外一個(gè)鈣通道蛋白TRPC6基因的表達(dá)。有研究報(bào)道，AngⅡ?qū)RPC6的激活依賴ROS的產(chǎn)生，如導(dǎo)致腎臟中H2O2的急性釋放[19]。又有研究報(bào)道，ROS可以通過(guò)MAPK信號(hào)通路抑制Nephrin的表達(dá)[20]，而Nephrin可以依賴性的通過(guò)酪氨酸磷酸化途徑抑制TRPC6的過(guò)表達(dá)，從而抑制腎小球硬化癥的發(fā)生[21]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以顯著抑制AngⅡ引起的足細(xì)胞ROS的增加，并顯著提高細(xì)胞內(nèi)Nephrin的含量。由此推測(cè)，在AngⅡ造成大鼠腎損傷的過(guò)程中，同時(shí)伴隨著NMDA受體和TRPC6蛋白兩個(gè)離子通道的激活，Ca2+的大量?jī)?nèi)流抑制了PI3K基因的表達(dá)，上調(diào)了細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，啟動(dòng)了足細(xì)胞的凋亡程序。在這一過(guò)程中，TRPC6可能位于NMDA受體調(diào)控的下游，NMDA受體介導(dǎo)了Ca2+的內(nèi)流，從而增加了細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，使細(xì)胞內(nèi)的Nephrin受到抑制，使TRPC6出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，從而加速了Ca2+的內(nèi)流。而黃芪多糖并未對(duì)NMDA受體和TRPC6直接進(jìn)行調(diào)控，而是通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)Nephrin的含量，從而抑制了TRPC6的過(guò)表達(dá)對(duì)足細(xì)胞造成的損傷。但也有研究表明，NMDA受體的過(guò)表達(dá)同樣也會(huì)引起腎臟的纖維化、急性腎損傷和腎小球疾病[22]。所以說(shuō)，僅對(duì)TRPC6進(jìn)行抑制并不能阻止AngⅡ通過(guò)NMDA受體途徑對(duì)足細(xì)胞造成的損傷。在神經(jīng)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，TRPC6可以上調(diào)Calcineurin的含量，而Calcineurin對(duì)NMDA受體的功能具有抑制作用[23]。在本次對(duì)足細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在抑制TRPC6表達(dá)的同時(shí)，NR1受體并沒(méi)有顯著增加，這可能是因?yàn)辄S芪多糖抑制了TRPC6的表達(dá)，但并未對(duì)TRPC6通過(guò)Calcineurin途徑對(duì)NMDA受體的反饋調(diào)節(jié)進(jìn)行顯著抑制，從而有效避免了Ang Ⅱ通過(guò)NMDA受體途徑對(duì)足細(xì)胞造成的損傷。

本研究結(jié)果表明，黃芪多糖可以通過(guò)其抗氧化功能，抑制AngⅡ刺激后足細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，從而抑制TRPC6過(guò)度表達(dá)引起的Ca2+大量?jī)?nèi)流，進(jìn)而抑制了由Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而對(duì)足細(xì)胞起到了保護(hù)作用。與此同時(shí)，黃芪多糖并未對(duì)TRPC6的反饋調(diào)節(jié)通道產(chǎn)生顯著抑制，從而阻止了AngⅡ通過(guò)NMDA受體途徑對(duì)足細(xì)胞造成的損傷。