王 娟 儲(chǔ) 輝

1.江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院分院眼科，江蘇淮安 223002；2.江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院分院內(nèi)分泌科 江蘇淮安 223002

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊咭暳M(jìn)行性的下降，增加患者遠(yuǎn)期失明的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。部分地區(qū)的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[2]，DR 的發(fā)病率可超過(guò)475/萬(wàn)。在研究DR 的發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的變化可以在DR 的進(jìn)展中起重要的調(diào)節(jié)作用。血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）β1、TGF-β2 的表達(dá)上升，能夠通過(guò)誘導(dǎo)趨化因子的富集，增加視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞間質(zhì)成分的增生，進(jìn)而促進(jìn)DR 患者視網(wǎng)膜病變的病情進(jìn)展[4-5]。相關(guān)研究探討了TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)與DR 的關(guān)系，認(rèn)為在DR 患者中，TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)濃度明顯上升，并認(rèn)為TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)上升與DR 患者的病情進(jìn)展速度密切相關(guān)[6-7]，但缺乏對(duì)于不同DR 分型患者中TGF-β1、TGF-β2 的對(duì)比性分析。為了揭示TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)與非增值期DR（NPDR）、增值期DR（PDR）的病情關(guān)系，從而為相關(guān)患者的診治提供理論參考。本研究選取在江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院分院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）治療的2 型糖尿病患者189 例，探討TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)及其與糖化血紅蛋白（HbA1c）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月—2018 年5 月在我院治療的2 型糖尿病患者189 例為研究對(duì)象，其中DR 患者61 例（DR 組），DR 組中，NPDR 患者38 例，PDR 患者23 例。無(wú)DR 患者128 例（NDR 組）。選擇同期健康體檢者100 名作為對(duì)照組。DR 組、NDR 組和對(duì)照組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：①DR 診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)[8]；②患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有腦出血、心肌梗死、酮癥酸中毒、腫瘤、甲狀腺疾病等其他基礎(chǔ)性疾??；②1 型糖尿??；③青光眼、白內(nèi)障、屈光間質(zhì)混濁、眼部手術(shù)史等。

表1 三組一般資料比較

1.2 檢查方法

從患者肘部收集4 mL 靜脈血，自然凝結(jié)后，收集上部澄清液體，并在-20℃的冰箱中保存。使用日立自動(dòng)生化分析儀7600 和該公司的輔助試劑檢測(cè)空腹血糖和HbA1c，并按照手冊(cè)中試劑盒測(cè)試的相關(guān)程序進(jìn)行操作。

采用Western blot 進(jìn)行TGF-β1、TGF-β2 蛋白的檢測(cè)：采集患者肘部靜脈血4 mL，自然凝固后采集上層清亮液體，-20℃放置冰箱保存。加入武漢艾美捷科技有限公司生產(chǎn)的血清總蛋白提取液體5 mL，1500 r/min 離心15 min，收集上層清涼液體，加入博士德BCA 檢測(cè)蛋白濃度，按照檢測(cè)蛋白與緩沖液1∶5的比例進(jìn)行煮沸，按照每個(gè)孔50 μg 的蛋白進(jìn)行上樣，進(jìn)行電泳、封閉和轉(zhuǎn)膜，加入TGF-β1、TGF-β2 蛋白抗體（1∶800），4℃下過(guò)夜孵育，去除相關(guān)液體后進(jìn)行TBST 液體清洗，3 次，每次5 min，加入TGF-β1、TGF-β2蛋白二抗（1∶1500），TBST 液體清洗，3 次，每次5 min，進(jìn)行顯影劑顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較使用方差分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c 比較

DR 組血清TGF-β1、TGF-β2 和HbA1c明顯高于NDR 組和對(duì)照組（P ＜0.05）；空腹血糖明顯高于對(duì)照組（P ＜0.05）；NDR 組TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c高于對(duì)照組（P <0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組血清TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c 比較（）

表2 三組血清TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c 比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與NDR 組比較，#P ＜0.05。DR：糖尿病視網(wǎng)膜病變；NDR：無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；HbA1c：糖化血紅蛋白

2.2 DR 組不同分型患者血清TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c 比較

DR 組PDR 患者血清TGF-β1、TGF-β2 和HbA1c明顯高于NPDR 患者（P ＜0.05）；PDR 和NPDR 患者空腹血糖比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 DR 組不同分型患者血清TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c 比較（）

表3 DR 組不同分型患者血清TGF-β1、TGF-β2、空腹血糖、HbA1c 比較（）

注：NPDR：非增值期糖尿病視網(wǎng)膜病變；PDR：增值期糖尿病視網(wǎng)膜病變；TGF：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；HbA1c：糖化血紅蛋白

2.3 相關(guān)性分析

將DR 患者血清TGF-β1、TGF-β2 與空腹血糖、HbA1c進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：TGF-β1、TGF-β2 與空腹血糖無(wú)明顯相關(guān)性（P ＞0.05）；TGF-β1、TGF-β2與HbA1c呈正相關(guān)（r=0.347、0.457，P ＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 DR 患者血清TGF-β1、TGF-β2 與HbA1c 相關(guān)性結(jié)果

3 討論

高滲高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激性損傷，局部炎癥反應(yīng)的激活，均能夠促進(jìn)DR 的發(fā)生，在2 型糖尿病病程較長(zhǎng)或者長(zhǎng)期空腹血糖控制不佳的患者中，DR 的發(fā)病率可進(jìn)一步的上升[9-10]。臨床上的隨訪觀察研究發(fā)現(xiàn)，DR 患者發(fā)生玻璃體變性、視網(wǎng)膜渾濁、偏盲、視力喪失的風(fēng)險(xiǎn)均明顯上升[11-12]。目前，缺乏針對(duì)患者的血清學(xué)指標(biāo)，血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)具有方便、操作可量化等優(yōu)勢(shì)[13]。雖然部分研究者主張通過(guò)血清半胱氨酸或者胱抑素進(jìn)而評(píng)估DR 患者的病情，但部分單中心的臨床分析研究發(fā)現(xiàn)，采用半胱氨酸評(píng)估DR 患者視網(wǎng)膜病變的靈敏度不超過(guò)45%，評(píng)估DR 患者病情的一致性率較低[14-15]。本研究分析了DR 患者血清中TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)，能夠?yàn)榕R床上DR 的診療提供血清學(xué)方面的參考指標(biāo)。

TGF-β1、TGF-β2 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族成員，其能夠通過(guò)誘導(dǎo)下游趨化因子或者生長(zhǎng)因子的富集，增加其對(duì)于上皮細(xì)胞遷移、增生、凋亡的調(diào)控障礙[16-18]。TGF-β1、TGF-β2 結(jié)構(gòu)上含有的絲氨酸和多重巰基結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞膜上糖蛋白配體的激活，進(jìn)而干預(yù)到視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞周期[19-20]。基礎(chǔ)方面的研究認(rèn)為，TGF-β1、TGF-β2 能夠提高視網(wǎng)膜組織的氧化應(yīng)激性損傷，促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加，最終加劇視網(wǎng)膜血管的漏出，促進(jìn)視網(wǎng)膜代償性纖維化等病理改變的出現(xiàn)[21-22]。相關(guān)研究者已經(jīng)探討了TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)與DR 的病情關(guān)系，認(rèn)為在DR 患者中，TGF-β1、TGF-β2 的上升與DR 患者的不良臨床結(jié)局的發(fā)生密切相關(guān)[23]，但缺乏對(duì)于二者在PDR 或者NPDR 中的分析研究。

本研究通過(guò)對(duì)于DR 患者血清中TGF-β1、TGFβ2 的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在DR 患者中，TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)濃度明顯上升，同時(shí)HbA1c的表達(dá)濃度也明顯上升，HbA1c的表達(dá)上升提示DR 患者近期血糖控制情況較差，而TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)上升提示二者在促進(jìn)DR 的病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。分析潛在原因，考慮TGF-β1、TGF-β2 病理變化的以下方面[24-28]：①TGF-β1 的表達(dá)上升，能夠促進(jìn)白細(xì)胞的遷移和滲出，提高了白細(xì)胞對(duì)于視網(wǎng)膜組織的浸潤(rùn)和黏附；②TGF-β2 的表達(dá)上升，能夠加劇血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，提高巨噬細(xì)胞進(jìn)入玻璃體和視網(wǎng)膜的速度。羅潔等[29]研究者也發(fā)現(xiàn)，在DR 患者中，TGF-β的表達(dá)增加了45%以上，在具有明顯的視力下降或者視網(wǎng)膜微血管硬化的患者中，TGF-β 的表達(dá)濃度上升更為顯著。PDR 患者的視網(wǎng)膜增生性改變較為明顯，可以發(fā)現(xiàn)在PDR 患者中，TGF-β1、TGF-β2 和HbA1c的表達(dá)濃度均明顯上升，高于NPDR 組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異較為顯著，提示TGF-β1、TGF-β2 和HbA1c的高表達(dá)與PDR 的發(fā)生密切相關(guān)，這主要由于TGF-β1、TGF-β2 和HbA1c的上升，能夠影響到成纖維細(xì)胞的成熟，提高膠原纖維蛋白的合成，加劇視網(wǎng)膜間質(zhì)成分的纖維化，最終促進(jìn)視網(wǎng)膜組織的增生。臨床上可以通過(guò)檢測(cè)TGF-β1、TGF-β2，進(jìn)而評(píng)估PDR 患者視網(wǎng)膜的增生狀態(tài)。最后相關(guān)性分析可見(jiàn)，TGF-β1、TGF-β2 與HbA1c呈正相關(guān)，提示TGF-β1、TGF-β2與DR 患者的近期血糖控制狀態(tài)密切相關(guān)，血糖控制不佳的患者，其高滲高血糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)激活，能夠顯著促進(jìn)TGF-β1、TGF-β2 的釋放。

綜上所述，在DR 患者中，TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)明顯上升，同時(shí)TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)與DR 患者的視網(wǎng)膜增生期改變或者近期血糖控制情況密切相關(guān)。本研究未探討TGF-β1、TGF-β2 的表達(dá)與DR患者遠(yuǎn)期臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，存在一定的不足。