郭中華 李更生 其木格 張志平 劉偉偉 王曉冰

1.河南太龍藥業(yè)股份有限公司研發(fā)部，河南鄭州 450001；2.河南省中醫(yī)藥研究院科教科，河南鄭州 450001

化肝煎是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中疏肝解郁、清肝瀉火的代表方劑，收載于《景岳全書》（明·張景岳），全方由青皮、陳皮、炒梔子、芍藥、丹皮、澤瀉、浙貝母七味藥配伍而成，用于治療氣逆動火、郁怒傷肝等，效果較好，臨床應(yīng)用廣泛[1-2]。

目前有關(guān)化肝煎的研究多集中在臨床應(yīng)用及藥理作用方面[3-4]，而有關(guān)其質(zhì)量研究方面的報道較少，僅有文獻[5]報道其指紋圖譜測定方法及3 種成分含量測定方法，其可控成分含量占比約3.05%，雖對評價化肝煎質(zhì)量提供了一定方法，但仍有很多物質(zhì)基礎(chǔ)組成無法整體了解。結(jié)合化肝煎中各藥味化學(xué)成分及藥理作用，本研究采用紫外-可見分光光度法（UV-Vis）[6]法測定其總黃酮[7-8]、多糖[9-10]及無機鹽三大類成分含量，分析化肝煎物質(zhì)基礎(chǔ)組成，擺脫了定量須先分離的束縛，實現(xiàn)了未能完全分離的復(fù)方大類成分的定量；此外還采用高效液相色譜法（HPLC）[5]同時測定化肝煎中沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量，通過測定復(fù)方中大類成分及多種有效成分的含量，以期為化肝煎質(zhì)量控制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Ultimate 3000 高效液相色譜儀、DAD-3000 二極管陣列檢測器（賽默飛世爾科技有限公司）；TU-1900 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；MS105DU 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.1.2 試劑與試藥 乙腈、甲醇，色譜純（默克化工技術(shù)有限公司）；磷酸，色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、乙酸乙酯，分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；苯酚，分析純（天津市富宇精細化工有限公司）等；對照品橙皮苷（批號：110721-201818，質(zhì)量分數(shù)為96.2%）、梔子苷（批號：110749-201718，質(zhì)量分數(shù)為97.6%）、芍藥苷（批號：110736-201943，質(zhì)量分數(shù)為95.1%）、沒食子酸（批號：110831-201605，質(zhì)量分數(shù)為90.8%）、D-無水葡萄糖（批號：110833-201908，質(zhì)量分數(shù)為99.8%）均購于中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷對照品（批號：250107-201812，質(zhì)量分數(shù)≥98%）購于上海鴻永生物科技有限公司；將化肝煎所用飲片按浸出物高配高、低配低進行組合，依次編號為S1～S16。

1.2 總黃酮含量測定方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成0.2553 mg/mL 的橙皮苷對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取凍干粉0.25 g 置具塞錐形瓶中，加水25 mL 超聲使溶解，搖勻，精密量取20 mL 置分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液蒸干，殘渣加70%乙醇溶解于20 mL 量瓶，以70%乙醇定容，搖勻，精密吸取2 mL 于50 mL 量瓶中，以70%乙醇定容，搖勻即得。

1.2.3 測定波長的選擇 精密量取橙皮苷對照品溶液0.6 mL 置10 mL 量瓶中，以70%乙醇定容，對對照品和供試品進行全波長掃描（190～800 nm），選最大吸收波長283 nm 為測定波長。

1.2.4 標準曲線的制備 精密量取橙皮苷對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL 量瓶中，以70%乙醇定容，70%乙醇為空白，在283 nm 處測吸光度，以濃度對吸光度進行線性回歸。

1.2.5 測定法 吸取供試品溶液，測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算供試品中橙皮苷含量。

1.3 多糖含量測定方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品適量，加水制成0.1033 mg/mL 的D-無水葡萄糖溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取凍干粉0.25 g 加水20 mL，超聲處理30 min，搖勻，精密量取1 mL 置離心管后加入乙醇25 mL 搖勻，冷藏4 h 取出，離心5 min，棄去上清液，沉淀揮干乙醇，加熱水使溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中放冷，以水定容，搖勻即得。

1.3.3 顯色反應(yīng) 精密量取供試品溶液1 mL、D-無水葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置具塞試管中，加水補至2 mL，精密加入1 mL 5%苯酚溶液搖勻，迅速精密加入5 mL 硫酸搖勻，放置10 min，置45℃水浴中保溫10 min，取出迅速冷卻至室溫。

1.3.4 測定波長的選擇 精密量取對照品、供試品溶液0.6、1.0 mL，分別置具塞試管中，按“1.3.3”項下顯色，對兩者進行全波長掃描（190～800 nm），選最大吸收波長490 nm 為測定波長。

1.3.5 標準曲線的制備 精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于具塞試管中，水為空白，按“1.3.3”項下顯色，在490 nm 處測吸光度，以濃度對吸光度進行線性回歸。

1.3.6 測定法 測定顯色后供試品溶液吸光度，并根據(jù)標準曲線計算供試品中D-無水葡萄糖含量。

1.4 無機鹽含量測定方法

精密稱取凍干粉2.00 g，參照2015 版《中華人民共和國藥典》[11]“四部”通則2302 灰分測定法進行試驗，無機鹽不做方法學(xué)考察。

1.5 5 種有效成分含量測定方法

1.5.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品適量，加甲醇制成濃度分別為301.27、1031.63、504.41、297.53、247.62 μg/mL的對照品溶液，再分別精密量取適量，加甲醇稀釋成濃 度 分 別 為60.25、154.74、50.44、59.51、49.52 μg/mL的對照品溶液。

1.5.2 供試品溶液制備 精密稱取凍干粉2.00 g 置錐形瓶中，加水50 mL 煎煮30 min，放冷濾過，精密量取濾液5 mL 蒸干，殘渣加70%乙醇適量，轉(zhuǎn)移至20 mL量瓶中超聲處理15 min，以70%乙醇定容，搖勻濾過，取續(xù)濾液即得。

1.5.3 色譜條件 色譜柱為Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流速0.9 mL/min；檢測波長230 nm；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），進行梯度洗脫（0～20 min，5%～15%A；20～35 min，15%～20%A；35%～45 min，20%～30%A；45～60 min，30%～45%A；60～61 min，45%～5%A；61～90 min，5%A）；供試品進樣5 μL，對照品進樣10 μL；理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計算應(yīng)不低于3000。

精密量取各對照品溶液適量，加甲醇稀釋制成混合對照品溶液，該色譜條件下對照品與供試品HPLC圖譜見圖1。

圖1 對照品與供試品圖譜

2 結(jié)果

2.1 總黃酮、多糖方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 分別按“1.2.4”“1.3.5”下項制備標準曲線，得橙皮苷、D-無水葡萄糖線性回歸方程分別為A=10.2275C+0.0018（r=0.9992）、A=8.2694C-0.0056（r=0.9991），提示橙皮苷、D-無水葡萄糖分別在0.0051～0.0306、0.0103～0.0620 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗 精密量取兩種對照品溶液各0.6 mL，制備相應(yīng)溶液并分別連續(xù)測定吸光度各6 次，計算橙皮苷、D-無水葡萄糖吸光度RSD 值分別為0.55%、0.64%，提示儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗 精密稱取S1 凍干粉0.25 g，總黃酮、多糖供試品溶液各平行制備6 份，分別測定吸光度，計算其吸光度RSD 值分別為1.72%、1.66%，提示方法重復(fù)性好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取S1 凍干粉0.25 g，總黃酮、多糖供試品溶液制備后分別于0、10、20、30、40、50、60 min 測定吸光度，計算其吸光度RSD 值分別為1.58%、1.41%，提示供試品溶液在1 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取0.20 g S1 凍干粉18 份，9 份添加等量橙皮苷對照品溶液，9 份添加等量D-無水葡萄糖對照品，供試品溶液制備后分別測定吸光度，計算含量及加樣回收率，數(shù)據(jù)見表1，提示準確度良好。

表1 總黃酮、多糖加樣回收率數(shù)據(jù)

2.1.6 樣品含量測定 取16 批化肝煎樣品，制備相應(yīng)供試品并測定吸光度，計算16 批樣品中總黃酮、多糖、無機鹽的含量。結(jié)果示16 批樣品中總黃酮、多糖、無機鹽含量范圍分別為2.61%～3.52%、11.65%～16.49%、7.10%～10.20%，平均含量分別為2.99%、13.92%、8.55%，見表2，提示不同批次樣品中各大類成分的含量存在一定差異。

表2 16 批化肝煎中總黃酮、多糖、無機鹽的含量（%）

2.2 5 種有效成分方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“1.5.1”項下稀釋前對照品溶液適量，加甲醇分別配制成6 個質(zhì)量濃度，進樣測定，記錄色譜圖及峰面積，以質(zhì)量濃度對峰面積進行線性回歸，繪制標準曲線，見表3。提示各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 線性關(guān)系結(jié)果

2.2.2 精密度試驗 取“1.5.1”項下稀釋后對照品溶液，進樣測定，分別連續(xù)進樣6 次，計算沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積RSD 值分別為0.26%、0.15%、0.09%、0.20%、0.18%，提示儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗 精密稱取S1 凍干粉2.00 g，平行制備6 份供試品并測定，計算沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積RSD 值分別為1.15%、1.36%、0.95%、0.88%、0.65%，提示方法重復(fù)性好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取化肝煎供試品溶液S1，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，計算沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積RSD 值分別為1.02%、1.24%、1.39%、0.93%、0.79%，提示供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取0.4 g S1 凍干粉9 份，添加適量一定質(zhì)量濃度的5 種對照品溶液，制備供試品，測定含量并計算各成分加樣回收率，數(shù)據(jù)見表4。

表4 5 種成分加樣回收率數(shù)據(jù)

2.2.6 化肝煎樣品含量測定 制備16 批化肝煎供試品并測定，計算樣品中沒食子酸、梔子苷、芍藥苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量，其質(zhì)量分數(shù)分別為0.36%～1.12%、1.40%～3.01%、1.73%～4.58%、0.12%～0.51%、0.62%～1.62%，平均含量分別為0.56%、1.94%、2.37%、0.22%、0.89%，見表5，提示不同批次樣品中各成分含量存在一定差異。

表5 16 批化肝煎中5 種成分的質(zhì)量分數(shù)（%）

3 討論

3.1 大類成分含量測定成分及測定方法的確定

單味中藥及中藥復(fù)方發(fā)揮功效是由于其中多種有效成分共同作用，也是中藥多靶點效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，從控制有效性上來講，測定復(fù)方總成分含量要比測定單一成分效果好，更科學(xué)。因此，測定大類成分含量對保證化肝煎質(zhì)量意義重大。

化肝煎中青皮[12]主要含黃酮類、揮發(fā)油等；陳皮[13]主要含黃酮類、揮發(fā)油、微量元素等；炒梔子[14]主要含環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類等；白芍[15-16]主要含單萜及其苷類、黃酮類、多糖、有機酸類、微量元素等；牡丹皮[17]主要含單萜及其苷類、有機酸類、多糖等；澤瀉[18]主要含黃酮類、多糖等；浙貝母[19]主要含生物堿等。

化肝煎中君藥陳皮、青皮，臣藥炒梔子、白芍、牡丹皮中均含黃酮類化合物，這類化合物在自然界廣泛存在，藥理作用廣，如抗氧化、抗炎等，常作為質(zhì)量控制指標[20-22]。通常運用UV-Vis 法測定總黃酮含量，化肝煎君藥中起主要藥效的成分是橙皮苷，2015 版《中華人民共和國藥典》[11]將橙皮苷作為陳皮、青皮的含量測定指標，結(jié)合文獻，最終確定以橙皮苷為指標來測定總黃酮的含量[7-8]?？傸S酮含量測定方法有直接測定法、三氯化鋁顯色法、堿液顯色法、硝酸鋁顯色法等[23-26]，通過對比分析上述常用的4 種方法對于化肝煎的適用性，以此得到較為準確的檢測方法，對對照品及供試品進行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，直接測定法中橙皮苷對照品和供試品光譜掃描曲線相似度較高，特征峰重疊較好，附近無過多干擾峰，相較于其他方法干擾較小、效果要好，且該方法操作簡便，根據(jù)試驗結(jié)果選擇283 nm 為檢測波長，故為了最大限度地測定以橙皮苷為主的黃酮類化合物的含量，本研究采用干擾相對較小、較為接近真實值的直接測定法，更加科學(xué)準確的判斷要在更多黃酮單品經(jīng)精確測定之后才能得出。

臣藥白芍、牡丹皮中均含有大分子物質(zhì)多糖，白芍多糖[27]具抗氧化作用，牡丹皮多糖[28]在免疫調(diào)節(jié)方面具有一定作用。多糖含量測定通常采用UV-Vis法，選用D-無水葡萄糖作為對照品，經(jīng)查閱文獻[9-10]，其測定多采用苯酚-硫酸法，本研究也采用此法進行測定。

化肝煎多種藥味均含常量元素，且陳皮、白芍中還含微量元素，這些無機鹽是人體不可或缺的營養(yǎng)素，也具一定藥理作用，如陳皮中微量元素有一定強心、抗休克[13]作用。中藥灰分來源主要為中藥經(jīng)灰化后遺留的不揮發(fā)性無機鹽，是衡量中藥材質(zhì)量的重要指標，故采用灰分測定法進行測定。

本研究主要測定總黃酮、多糖、無機鹽的含量，涵蓋了化肝煎所具有的大類物質(zhì)基礎(chǔ)，三大類成分含量總計約25.46%，可以反應(yīng)出化肝煎物質(zhì)基礎(chǔ)組成，為其質(zhì)量評價提供依據(jù)。

3.2 多成分含量測定成分的確定

橙皮苷、蕓香柚皮苷是君藥陳皮、青皮的主要活性成分；梔子苷是臣藥炒梔子的主要活性成分；芍藥苷、沒食子酸是臣藥白芍、牡丹皮的主要活性成分，因此本研究選取起主要藥效的橙皮苷、梔子苷及起次要藥效的蕓香柚皮苷、芍藥苷、沒食子酸作為含量測定指標，建立同時測定其含量的HPLC 法并進行方法學(xué)考察。

綜上，本研究通過采用測定化肝煎大類成分的含量與測定單一成分的含量相結(jié)合的方法，既能涵蓋該品種所具有的大類物質(zhì)基礎(chǔ)，也能控制起主要藥效的化學(xué)成分的含量，可以更充分反應(yīng)化肝煎的質(zhì)量，5 種有效可控成分總含量約5.98%，大類成分及單一成分含量總計約31.44%，占比相對較高，能較好體現(xiàn)化肝煎物質(zhì)基準物質(zhì)基礎(chǔ)的組成，可為化肝煎質(zhì)量評價提供較為全面的方法和依據(jù)，也可為后續(xù)復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究提供參考。