蘭云艷，馮煜然，鄭 宇，楊振東，趙 詣，朱 梅

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科，云南 昆明 650032）

近年來，神經(jīng)調控技術逐漸發(fā)展為神經(jīng)機制科學研究的重要工具，也在腦功能疾病的治療方面有著新興的發(fā)展：腦深部刺激（deep brain stimulation，DBS）、迷 走 神 經(jīng) 刺 激（vagus nerve stimulation，VNS）、重復經(jīng)顱磁刺激（repeated transcranial magnetic stimulation，rTMS）等神經(jīng)調控技術已被美國食品和藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準治療帕金森病、肌張力障礙、強迫癥、癲癇和抑郁癥等疾病[1]。以上常用的神經(jīng)調控技術能有效促進或抑制腦功能疾病患者的大腦認知功能，然而均受到了空間聚焦能力以及操作創(chuàng)傷性的限制。超聲神經(jīng)刺激可以無創(chuàng)經(jīng)顱靶向特定的大腦區(qū)域并調節(jié)特定的神經(jīng)通路或神經(jīng)元，神經(jīng)調控常運用低強度聚焦超聲（low-intensity focused ultrasound，LIFU）進行刺激。LIFU結合了操作無創(chuàng)性、空間分辨率高以及靶點控制便捷等特性，在腦科學領域擁有美好的發(fā)展前景。伏隔核（nucleus accumbens，NAc）是中腦邊緣獎賞環(huán)路的關鍵節(jié)點，常作為干預包括成癮在內的各種精神障礙的靶點[2]。目前國內外鮮有關于LIFU調控NAc的實驗研究。本研究旨在通過對小鼠的NAc腦區(qū)進行超聲刺激，觀察小鼠行為學的改變、NAc超微結構的改變及單胺類神經(jīng)遞質含量的變化，初步探討超聲神經(jīng)刺激的作用機制，為腦科學的新興治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與分組C57BL/6小鼠，雄性，6～7周齡，體質量18～22 g，共100只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（湘）2019-0004。適應性飼養(yǎng)1周后將其隨機分為實驗組和對照組各50只，待超聲刺激及假刺激后，2個大組內又隨機分為行為學評估30只（分別進行強迫游泳、曠場和水迷宮實驗）、電鏡檢測10只和神經(jīng)遞質檢測10只，立刻進行相關檢測。實驗動物的處理方法均經(jīng)昆明醫(yī)科大學實驗動物管理委員會審核批準。以上實驗分批次進行，各批次間開始超聲刺激的時間、超聲刺激參數(shù)等嚴格控制不變。

1.1.2 試劑與儀器多巴胺（Dopamine，DA）、去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）ELISA試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；；強迫游泳、曠場實驗、Morris水迷宮、腦立體定位儀、小動物麻醉機（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；超聲神經(jīng)刺激儀（中國科學院深圳先進技術研究院）；全自動樣品快速研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；全波長酶標儀（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科研中心實驗室提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲刺激濃度為1.5%的異氟烷麻醉小鼠，將小鼠固定于腦立體定位儀上，根據(jù)小鼠腦圖譜找到NAc所在位置（以Bregma為坐標原點，X軸±0.05 cm，Y軸+0.12 cm），見圖1。超聲神經(jīng)刺激儀進行超聲輻照，探頭頻率0.5 MHz，脈沖重復頻率（Pulse repetition frequency，PRF）1 000 Hz，脈沖聲壓590 kPa，脈沖時間0.5 ms，脈沖周期1 ms，刺激時間300 ms，刺激間隔3 s，刺激總時間10 min，每日2次，持續(xù)7 d。對照組以同樣的方式操作，不開啟設備。

圖1 LIFU刺激小鼠NAc圖Fig.1 Image of NAC stimulated by LIFU

1.2.2 行為學評價（1）強迫游泳：小鼠被放入裝有水的圓柱形透明水缸中，讓小鼠強迫游泳6 min，視頻攝像觀察第2～6 min時間內小鼠漂浮不動的時間。

（2）曠場實驗：實驗裝置為由木板制成的無蓋方箱，檢測時將小鼠逐只放置在方箱中央，攝像記錄小鼠在5 min內的行為和活動情況。檢測指標包括：小鼠在曠場內行進總距離、行進平均速度、中心區(qū)活動距離、中心區(qū)停留時間以及中心區(qū)穿越次數(shù)。

（3）Morris水迷宮：Morris水迷宮通過等距的邊緣和方向將水池劃分為四個象限。第一象限為目標象限，平臺放至第一象限。測試前一天將每組小鼠放在平臺上15 s以適應環(huán)境，并讓它們自由游泳1 min。1～6 d進行空間導航實驗，每組小鼠在平臺上放置15 s，后按四個象限順序依次放入水中，小鼠登上平臺并停留5 s視為上臺成功，最長測試時間為60 s。如果小鼠在60 s后仍未登上平臺，則引導其至平臺停留10 s以強化記憶。第7 d撤去平臺，將小鼠由目標象限的對位象限（即第三象限）放入水中，進行60 s的空間探索實驗。以定位航行實驗目標象限的對面象限（即第三象限）為入水點的逃避潛伏時間（小鼠登上平臺所用的時間）、跨越平臺的次數(shù)和目標象限的停留時間為檢測指標評價小鼠的學習記憶能力。

1.2.3 神經(jīng)元超微結構觀察超聲干預結束后，8%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，開胸暴露心臟，在右心耳開一小口，于心尖（左心室）快速灌注預冷的生理鹽水，直至灌注液接近無色，換用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，灌注結束后于冰上迅速取腦，用預冷的生理鹽水沖洗殘留血液，濾紙拭干后，參照小鼠腦圖譜迅速分離NAc至1 mm3，置于含3%戊二醛的1.5 mL EP管中，4 ℃保存待送電鏡室。

1.2.4 單胺類神經(jīng)遞質含量測定超聲干預結束后，8%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉小鼠，斷頭處死，于冰上迅速分離腦組織，取NAc，用預冷的PBS沖洗殘留血液，稱重后剪碎。按1 g∶9 mL的重量體積比往剪碎的NAc組織中加入對應體積的PBS，后于高通量研磨儀中充分研磨。最后將勻漿液于5 000×g離心10 min，取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS25.0進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料用表示，2組間差異用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組小鼠強迫游泳實驗結果比較

如表1所示，在強迫游泳實驗中，超聲刺激組小鼠在水中漂浮不動的時間為46.29 s，明顯長于對照組的16.67 s（P＜0.001），表明超聲刺激組小鼠在無可逃避的壓迫環(huán)境中興奮性降低，表現(xiàn)出絕望不動的狀態(tài)，在生理和心理上均表現(xiàn)出類似抑郁的癥狀。

表1 LIFU對小鼠強迫游泳實驗漂浮不動時間的影響（）Tab.1 Effect of LIFU on floating immobility time of mice in forced swimming experiment（）

表1 LIFU對小鼠強迫游泳實驗漂浮不動時間的影響（）Tab.1 Effect of LIFU on floating immobility time of mice in forced swimming experiment（）

與對照組比較，***P＜0.001。

2.2 2組小鼠曠場實驗結果比較

如表2所示，曠場實驗中，超聲刺激組小鼠較對照組在曠場中行進總距離、行進平均速度、中央?yún)^(qū)活動距離、中央?yún)^(qū)停留時間和中央?yún)^(qū)穿越次數(shù)均顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），表明超聲刺激組小鼠在面對空曠陌生的環(huán)境時表現(xiàn)出探究欲望減少、自主活動減少等類似焦慮的行為狀態(tài)。

表2 LIFU對小鼠曠場實驗各項指標的影響（）Tab.2 Effects of LIFU on various indicators of open field experiment in mice（）

表2 LIFU對小鼠曠場實驗各項指標的影響（）Tab.2 Effects of LIFU on various indicators of open field experiment in mice（）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 2組小鼠水迷宮實驗結果比較

如表3所示，水迷宮實驗中，超聲刺激組小鼠較對照組逃避潛伏時間明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，在目標象限停留時間明顯縮短（P＜0.05，P＜0.01）。如圖2所示，超聲刺激組小鼠較對照組游泳距離明顯較長，且在目標象限活動的路程明顯較短，表明超聲刺激組小鼠空間學習記憶能力明顯減弱。

圖2 2組小鼠的游泳路徑圖Fig.2 Swimming paths of the two groups of mice

表3 LIFU對小鼠水迷宮實驗各項指標的影響（）Tab.3 Effects of LIFU on various indicators of water maze experiment in mice（）

表3 LIFU對小鼠水迷宮實驗各項指標的影響（）Tab.3 Effects of LIFU on various indicators of water maze experiment in mice（）

與對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.4 2組小鼠神經(jīng)元超微結構改變

對照組神經(jīng)元核大、圓，核仁多，染色質多，核膜清晰（圖3A），胞漿內細胞器豐富，內質網(wǎng)、高爾基體等結構清晰正常，線粒體結構基本正常，可見較清晰的內嵴與膜（圖3B）。超聲刺激組神經(jīng)元腫脹、變性甚至壞死，細胞核變小、溶解、固縮，染色質減少，核質界限不清（圖3C），胞漿內細胞器減少或消失，內質網(wǎng)擴張，線粒體內嵴排列紊亂或消失，呈空泡狀（圖3D）。

圖3 小鼠伏隔核神經(jīng)元的超微結構Fig.3 Ultrastructure of mouse nucleus accumbens neurons

2.5 2組小鼠單胺類神經(jīng)遞質含量測定結果

如表4所示，超聲刺激組與對照組比較，小鼠NAc單胺類神經(jīng)遞質NE、DA、5-HT的含量均明顯降低（P＜0.000 1），表明超聲刺激一定程度上降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。

表4 LIFU對小鼠單胺類神經(jīng)遞質含量的影響（）Tab.4 Effects of LIFU on monoamine neurotransmitters in mice（）

表4 LIFU對小鼠單胺類神經(jīng)遞質含量的影響（）Tab.4 Effects of LIFU on monoamine neurotransmitters in mice（）

與對照組比較，**P＜0.000 1。

3 討論

LIFU通過超聲換能器提供可精確調控的超聲波（機械波），作用于指定腦區(qū)，實現(xiàn)對該部位神經(jīng)核團的精準刺激，誘發(fā)其神經(jīng)活動和功能狀態(tài)的改變，從而在宏觀上實現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路和功能網(wǎng)絡的有效調控[3]。LIFU提供了一種空間分辨率高、穿透深度大的非侵入性技術，在基礎和臨床神經(jīng)科學研究中已被證明是一種有效的神經(jīng)調節(jié)工具[4-9]。LIFU可以通過傳遞機械振動來激活或抑制神經(jīng)元活動，而不會造成不可逆的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)通過改變超聲頻率、超聲強度、脈沖重復頻率、占空比及作用時間等超聲參數(shù)，不僅可以抑制刺激部位興奮性，而且可以根據(jù)聲強和能量沉積率增強其興奮性。Yoo等[10]用不同參數(shù)的LIFU刺激兔的視覺區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在100 Hz PRF、3.3 W/cm2Isppa的超聲作用下兔的視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）幅值降低，而較高強度的超聲作用導致VEP幅值升高。Kim等[11]在大鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的反應。LIFU介導的神經(jīng)調節(jié)的這種雙向性特征，表明其在神經(jīng)治療應用中具有多功能性。然而，這些研究中超聲脈沖參數(shù)的范圍相當有限，需要進一步的研究來闡明導致興奮性或抑制性神經(jīng)活動的脈沖參數(shù)。

近年來，為數(shù)不多的文獻以動物模型行為學為評價指標報道了LIFU的神經(jīng)調控作用。孟文[12]將LIFU施加到阿爾茲海默癥疾?。ˋlzheimer' s disease，AD）模型小鼠的海馬上，觀察到各組小鼠在中央?yún)^(qū)活動時間無顯著差異，而AD小鼠的自主學習能力有所提升，結果表明超聲刺激沒有增加AD小鼠的焦慮情緒，但是提高了AD小鼠的學習記憶能力（100 Hz PRF、5%占空比）。Lin等[13]用LIFU刺激AD模型大鼠海馬，水迷宮實驗示超聲刺激組比模型組的逃避潛伏時間顯著縮短，說明LIFU顯著改善了AD大鼠的學習記憶能力（1 Hz PRF、5%占空比）?，F(xiàn)有研究表明，超聲可以調節(jié)神經(jīng)遞質的表達水平，Min等[14]和Yang等[15]的研究顯示，LIFU作用于大鼠丘腦20 min，額葉細胞外GABA、DA、5-HT水平在超聲作用后開始下降，并在超聲作用2 h后保持在基線水平的82%左右。Wang等[16]使用超聲刺激PD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)超聲可以增加腦內紋狀體DA含量，提高PD模型的運動能力。Constans等[17]使用FUS結合超聲造影劑安全開放了獼猴的血腦屏障，并增加了腦內GABA的含量。

本實驗以正常小鼠為研究對象進行超聲神經(jīng)調控的研究，從行為學、形態(tài)學以及神經(jīng)生物化學多個方面評價超聲刺激后小鼠的改變。在行為學水平，實驗結果說明經(jīng)顱超聲刺激小鼠后產(chǎn)生了類似抑郁和焦慮的癥狀，學習記憶功能下降。在形態(tài)學方面，透射電鏡示超聲刺激后NAc神經(jīng)元腫脹，神經(jīng)纖維溶解、變性、壞死，胞漿內細胞器減少或消失。在神經(jīng)生物化學層面，ELISA結果示DA、NE、5-HT含量下降，表明超聲刺激一定程度上降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性。綜上，本實驗研究結果表明聚焦超聲剌激對正常小鼠大腦有一定的抑制性神經(jīng)調控作用。本次研究采用1 000 Hz PRF，50%占空比的脈沖超聲刺激小鼠NAc，實驗結果示超聲刺激后小鼠單胺遞質含量減少，影響了神經(jīng)信息的正常傳遞，情緒調節(jié)的神經(jīng)網(wǎng)絡被抑制，進而導致學習記憶能力下降，并產(chǎn)生了類似抑郁和焦慮的癥狀，得到了與上述研究相反的結果。針對這一結果作出以下可能的分析：本次研究采用了更高的PRF和占空比，超聲參數(shù)的不同可能引起不同的結果，孟文的研究[12]也說明了超聲對神經(jīng)元的調控具有雙向性。且上述研究使用AD模型小鼠，其神經(jīng)系統(tǒng)已發(fā)生了病理改變，而本次研究使用的是神經(jīng)系統(tǒng)功能正常的小鼠，這也可能是導致不同結果的原因之一。

綜上所述，本次研究給予小鼠NAc聚焦超聲剌激對小鼠大腦產(chǎn)生了一定的抑制性神經(jīng)調控作用，并在強迫游泳、曠場和水迷宮實驗結果中有所體現(xiàn)。且超聲誘導了NAc的形態(tài)學以及神經(jīng)生物化學改變，這可能是超聲發(fā)揮神經(jīng)調控作用的機制之一。

本實驗成功對小鼠進行超聲神經(jīng)調控，誘導正常小鼠行為學、神經(jīng)元形態(tài)學以及神經(jīng)生物化學改變，證明LIFU對小鼠可產(chǎn)生抑制性的神經(jīng)調控作用，為其下一步應用于疾病模型研究提供超聲參數(shù)依據(jù)以及機制研究基礎。