潘育文 肖海浩 湯春梅 張言斌 蘇鐸華 張 琳 李天義

肺結核是我國最常見的傳染病之一，其發(fā)病和死亡數(shù)長期占據(jù)我國法定傳染病報告的第二位，2019年全國報告的新發(fā)結核病為77.576 4萬例，發(fā)病率為55.5491/10萬[1]。肺結核復發(fā)是不容忽視的問題，國內的調查認為肺結核的復發(fā)率在5.3%～6.7%左右[2-3]，每年確診的肺結核復治病例不在少數(shù)。肺結核復治病例有其一定的特殊性，由于癥狀、體征多無特異性，血清學及免疫學檢查、胸部影像學檢查等很難迅速地做出精準的活動性判斷，確定肺結核是否為復治的“金標準”仍是病原學檢查。本研究對擬診為肺結核復治患者的痰或支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本，進行傳統(tǒng)的涂片找抗酸桿菌和分枝桿菌培養(yǎng)，同時進行2種分子生物學快速檢測：利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測(Gene Xpert MTB/RIF)和結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時熒光檢測( SAT-TB)，探討不同病原學檢測方法對診斷肺結核復治的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集廣州市胸科醫(yī)院結核內科 2019年1月—12月期間住院收治的擬診為肺結核復治患者的臨床資料。納入標準：①有咳嗽、咯痰、咯血、胸痛、呼吸困難等呼吸道癥狀，伴或不伴發(fā)熱、消瘦等全身中毒癥狀；②影像學檢查結果考慮有肺結核的影像學改變；③既往有肺結核病史，不合理或不規(guī)則用抗結核藥物≥1月或曾規(guī)律抗結核治療完成療程；④初治失敗；⑤痰或BALF均完成涂片找抗酸桿菌，分枝桿菌培養(yǎng)，Gene Xpert MTB/RIF和SAT-TB檢測。排除標準：①初治肺結核；②既往無肺結核病史；③病歷資料不完全。

診斷標準：復治肺結核與非活動性肺結核(含非結核分枝桿菌肺病)的診斷參考《WS288-2017肺結核診斷》的標準[4]；非活動性肺結核的其他肺部疾病診斷參考林果為主編的《實用內科學》呼吸系統(tǒng)疾病章節(jié)[5]。

1.2 儀器與方法

1.2.1 涂片找抗酸桿菌 根據(jù)中國防癆協(xié)會2006年版《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》,采用熒光涂片染色鏡檢法對標本進行涂片染色和鏡檢。

1.2.2 分枝桿菌培養(yǎng) 使用BectonDickinson公司的BACTEC MGIT 960系統(tǒng)，按照實驗說明書標準進行快速液體培養(yǎng)。

1.2.3 Gene Xpert MTB/RIF檢測 設備及試劑盒來自于賽沛公司,按照儀器、試劑操作說明書對標本進行檢測。

1.2.4 SAT-TB檢測 檢測試劑盒來自于上海仁度生物科技公司，應用ABI 7300熒光定量 PCR擴增儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 患者的一般情況

符合標準的患者共323例，其中男242人、女81人，年齡19～87歲，平均年齡(56.08±13.77)歲；最后診斷肺結核復治92例(28.48%)，非活動性肺結核231例(71.52%)，其中支氣管擴張并感染76例，肺炎61例，慢性肺曲霉病(Chronic pulmonary aspergillosis，CPA)55例，非結核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacteria,NTM)肺病36例，肺癌3例。

2.2 不同檢測方法的檢測結果

在肺結核復治確診病例組中Gene Xpert MTB/RIF的陽性檢出率為95.65%，分枝桿菌培養(yǎng)為89.13%,兩種方法進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(2=2.783 2，P>0.05)；SAT-TB的陽性檢出率78.26%,涂片法為69.57%，兩種方法進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(2=1.803 9P>0.05)；Gene Xpert MTB/RIF和分枝桿菌培養(yǎng)的陽性檢出率比SAT-TB和涂片法明顯較高(P<0.05)。見表1。

表1 323例患者不同檢測方法的結果 [n]

2.3 不同檢測方法的診斷效能

以最后確診肺結核復治作為標準，來評估不同檢測方法的效能，結果顯示：靈敏度的高低順序為Gene Xpert MTB/RIF>分枝桿菌培養(yǎng)>SAT-TB>涂片法；特異度的高低順序為SAT-TB>Gene Xpert MTB/RIF>涂片法>分枝桿菌培養(yǎng)；Youden指數(shù)的大小順序為Gene Xpert MTB/RIF>SAT-TB>分枝桿菌培養(yǎng)>涂片法；陽性預測值的高低順序為 SAT-TB>Gene Xpert MTB/RIF>涂片法>分枝桿菌培養(yǎng)；陰性預測值的高低順序為 Gene Xpert MTB/RIF>分枝桿菌培養(yǎng)>SAT-TB>涂片法，見表2。

表2 不同檢測方法對肺結核復治確診的診斷效能 [%]

3 討論

結核的轉歸方式，注定了大部分肺結核患者治愈后影像學檢查仍保留著結核的特點，當再次出現(xiàn)癥狀時，影像學檢查難以準確區(qū)分肺部病灶是否出現(xiàn)活動[6]。對肺結核活動性的判斷，常規(guī)的CRP、ESR等炎性指標無太多臨床意義，而傳統(tǒng)的結核菌素皮膚實驗(Tuberculin skin test,TST)和近年來廣泛開展的結核分枝桿菌特異性γ干擾素釋放試驗(Interferon gamma release assays,IGRAs)的價值也有限[7-8]。因此病原學檢查才是確定肺結核是否復治的金標準，涂片找抗酸桿菌、分枝桿菌培養(yǎng)和分子生物學檢測是目前臨床廣泛開展的結核分枝桿菌檢測技術。

涂片找抗酸桿菌在本組研究不同方法中，對肺結核復治確診病例的陽性檢出率最低，靈敏度也是最低，與國內研究報道一致[9]，Youden指數(shù)最小，其診斷效能最差。傳統(tǒng)的涂片找抗酸桿菌，雖然有簡單經(jīng)濟，易于開展的優(yōu)點，但其缺點也比較明顯：陽性率低，無法辨別死菌與活菌，不能區(qū)分是MTB還是NTM。近年來隨著分子生物學檢測手段的發(fā)展，涂片陽性的標本可進一步行線性探針技術( LPAs)、熒光 PCR 溶解曲線法、基因芯片技術等檢測,通過對結核分枝桿菌核酸能否檢出，從而可初步區(qū)分MTB或NTM，并對檢出的結核分枝桿菌進行異煙肼和利福平等主要抗結核藥物的耐藥快速檢測， 1～2天內可出報告結果[10]，因此涂片找抗酸桿菌對于肺結核復治確診及治療方案的制定，仍具有重要的參考價值。

本文的研究結果顯示分枝桿菌培養(yǎng)的靈敏度僅次于Gene Xpert MTB/RIF，對肺結核復治確診病例的陽性檢出率也較高，但特異度較差，診斷效能優(yōu)于涂片，但差于兩種分子生物學檢測方法。培養(yǎng)仍是目前診斷肺結核的金標準，快速液體法培養(yǎng)較傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)已有明顯改進，但平均報告陽性時間也要9．5～10．2 d[11-12]，耗時仍較長，仍很難滿足臨床的診療需要，但培養(yǎng)陽性后可進一步做菌型鑒定區(qū)分MTB還是NTM，同時做藥敏實驗，對最終的確診，臨床用藥的選擇以及后續(xù)耐藥性監(jiān)測等具有其他方法無法替代的作用。本研究中共有36.53%(118/323)的患者培養(yǎng)陽性，其中30.51%(36/118)通過菌型鑒定確定為NTM，因此當可疑肺結核復發(fā)患者的培養(yǎng)結果出現(xiàn)陽性時，應注意是否有NTM的可能，應等待最終菌型鑒定結果才能作出最后結論。

臨床需要快速、靈敏度和特異度高的病原學檢測技術來幫助診斷肺結核是否為復治，近年來發(fā)展起來的分子生物學檢測技術提供了可能。Gene Xpert MTB/RIF是世界衛(wèi)生組織唯一推薦用于快速診斷結核的檢測方法，以全自動半巢式實時熒光PCR技術為基礎，能在2 h內迅速檢出結核分枝桿菌，同時確定有無對利福平耐藥[13],是目前已知分子生物學檢測手段中具有最高靈敏度的方法[14]。本研究Gene Xpert MTB/RIF在肺結核復治確診病例組中陽性檢出率最高，和分枝桿菌培養(yǎng)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在四種檢測方法中靈敏度和陰性預測值最高，特異度和陽性預測值僅次于SAT-TB，Youden指數(shù)最大，反映出其極佳的診斷效能，這與國內外學者所做的研究基本一致[15-17]。本研究中非活動性肺結核也有6.06%(14/231)的患者Gene Xpert MTB/RIF陽性，但檢出結核分枝桿菌的濃度均為低或極低，考慮出現(xiàn)假陽性的主要原因是這些既往有肺結核的患者，體內仍存有死菌[18]，也存在標本污染的可能性。Gene Xpert MTB/RIF具有極高的靈敏度，但無法分辨死菌或活菌，因此對于肺結核復治的診斷時應注意，尤其是檢出濃度低或極低時應注意是否為死菌的可能。對于初治病例，當涂片陽性，同時Gene Xpert MTB/RIF檢測陽性，提示標本存在MTB，可做出活動性結核的診斷[19]，但對于復治病例，必須慎重，應結合臨床，綜合培養(yǎng)等其他檢測手段分析后再做判斷。本組非活動性肺結核病例中，36例NTM肺病有50%(18/36)涂片陽性，而同時Gene Xpert MTB/RIF僅有2.78%(1/36)為陽性，提示當涂片找抗酸桿菌陽性，而同時Gene Xpert MTB/RIF檢測陰性時，要高度懷疑NTM肺病的可能。

SAT-TB是一種應用恒溫RNA擴增和實時熒光技術同時檢測臨床標本中結核分枝桿菌復合物的方法，可在1.5～2 h內快速確定標本中有無結核分枝桿菌。而 RNA 只存在結核分枝桿菌活菌中，在結核菌死亡后會迅速發(fā)生降解，因此SAT-TB檢測可有效明確標本中有無存在活菌；同時與NTM等呼吸道病原體沒有交叉反應，是一種簡便、快捷、具有較高特異性的方法，可提高結核的檢出率[20]。本研究中SAT-TB對肺結核復治確診病例的陽性檢出率與涂片法接近(P>0.05)，低于Gene Xpert MTB/RIF和分枝桿菌培養(yǎng)(P<0.05)；在四種檢測方法中特異度和陽性預測值最高，Youden指數(shù)僅次于Gene Xpert MTB/RIF，說明SAT-TB對肺結核復治的診斷有高度的準確性，具有較好的診斷效能，其靈敏度和陰性預測值低于Gene Xpert MTB/RIF和培養(yǎng)，這與國內對3608例疑似肺結核患者進行SAT-TB檢測的大樣本研究結果相符[21]。從本研究可看出，當SAT-TB和Gene Xpert MTB/RIF同時陽性時，尤其是Gene Xpert MTB/RIF檢出結核分枝桿菌濃度為中等以上時，基本可判定為肺結核復治確診；而SAT-TB為陰性，同時Gene Xpert MTB/RIF檢出結核分枝桿菌濃度為低或極低時，應注意非活動性肺結核的可能，應聯(lián)合培養(yǎng)才能作出正確判斷。

綜上所述，Gene Xpert MTB/RIF具有較高的靈敏度，SAT-TB有較高的特異度，兩種分子生物學檢測方法對臨床快速診斷肺結核復治確診有著重要的應用價值，涂片和培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的檢測手段，仍具有不可替代的作用，多種方法聯(lián)合運用，綜合臨床分析，能對肺結核復治進行快速、準確的診斷。