劉慶煥，張 巖，傅 予，張 婷，王文彤

（天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

金花清感顆粒由金銀花、石膏、蜜麻黃、炒苦杏仁、黃芩、連翹、浙貝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草組成，具有疏風(fēng)宣肺、清熱解毒之功效［1］，主要用于單純型流行性感冒輕癥，為COVID-19治療的推薦中成藥［2］，通過臨床療效的同步觀察，對于輕度及普通型患者療效確切［3］。

中藥制劑均為多組分復(fù)雜體系，單一檢測指標(biāo)難以全面準(zhǔn)確評價其質(zhì)量，多指標(biāo)控制模式已逐步應(yīng)用于中藥制劑的質(zhì)量控制中，然而傳統(tǒng)的多指標(biāo)評價模式存在對照品數(shù)量眾多、價格昂貴等不足。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是以樣品中某一典型成分為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他待測成分間的相對校正因子，計(jì)算其他待測成分的含量，實(shí)現(xiàn)多種成分同時測定的同時，降低了檢測成本［4-5］。目前，關(guān)于金花清感顆粒的研究多集中在藥理作用、臨床觀察等方面［3，6-8］，而對其質(zhì)量評價方面的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以黃芩苷為內(nèi)參物，建立同時測定金花清感顆粒中黃芩苷、綠原酸、芒果苷、牛蒡苷、漢黃芩苷和甘草酸銨含量的一測多評方法，以期為金花清感顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀；島津LC-20AT高效液相色譜儀；色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；AB135-S型十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-520B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈、甲醇（色譜純，Sigma科技有限公司）；甲醇、乙醇、磷酸（分析純，天津市化學(xué)試劑供銷公司）；綠原酸對照品（批號110753-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）、黃芩苷對照品（批號110715-201318，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%）、甘草酸銨對照品（批號110731-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%）購于中國食品藥品檢定研究院；芒果苷對照品（MUST-18040123，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）、牛蒡苷對照品（批號MUST-20041510，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）購于成都曼斯特生物有限公司；漢黃芩苷對照品（批號19101501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）購于成都康邦生物科技有限公司；金花清感顆粒［規(guī)格：5 g/袋，批號分別為20200224、20200122、20200116，聚協(xié)昌（北京）藥業(yè)有限公司］；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），按表1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫25℃；體積流量1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；檢測波長：0～9 min，327 nm（綠原酸）；9～20 min，254 nm（芒果苷）；20～54 min，277 nm（黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷）；53～75 min，254 nm（甘草酸銨）。理論塔半數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不低于6 000。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷和甘草酸銨6種對照品適量，精密稱定，置于25 ml棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1 ml含綠原酸49.8 μg、芒果苷20.5 μg、黃芩苷228.4 μg、牛蒡苷410.2 μg、漢黃芩苷74.0 μg和甘草酸銨49.3 μg的混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液5 ml，置于10 ml棕色量瓶中，加入70%甲醇振搖后定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶劑，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，見圖1。供試品色譜中在與混合對照品色譜中綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨相應(yīng)位置位上均有色譜峰出現(xiàn)，且色譜峰之間的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于7 000，滿足含量測定的要求。

圖1 混合對照品（A）供試品（B）空白溶液（C）HPLC圖

2.3.2線性關(guān)系考查 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品儲備溶液1、2.5、5、7.5和10 ml置于10 ml量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度對照品溶液。分別吸取10 μl注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各待測成分的回歸方程及線性范圍見表2。結(jié)果表明各成分在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 金花清感顆粒6種成分線性關(guān)系考查結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計(jì)算綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨峰面積的RSD值分別為0.35%、1.41%、0.65%、0.18%、1.13%和1.07%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取金花清感顆粒樣品（批號20200122），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、3、6、9、12和24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。計(jì)算綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨含量的RSD值分別為0.90%、2.08%、0.36%、0.52%、0.14%和0.69%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號金花清感顆粒樣品（批號20200122）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。計(jì)算綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨含量的RSD值分別0.90%、0.91%、0.17%、0.26%、0.18%和0.08%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知6種成分含量的金花清感顆粒樣品（批號20200122）約0.1 g，共6份，精密稱定，分別按對照品加入量與供試品中待測成分含量的比為1∶1加入綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨對照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨的加樣回收率分別為98.00%、101.07%、97.69%、96.92%、96.79%和102.11%，RSD值分別為1.53%、1.78%、1.37%、1.62%、1.68%和1.67%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表3-8。

表3 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4 芒果苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表5 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表6 牛蒡苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表7 漢黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表8 甘草酸銨加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 一測多評法

2.4.1 相對校正因子 取“2.3.2”項(xiàng)下系列對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以黃芩苷為內(nèi)參物，按公式fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）計(jì)算相對校正因子，式中As為內(nèi)參物對照品s峰面積，Cs為內(nèi)參物對照品s濃度，Ai為某待測成分對照品i峰面積；Ci為某待測成分對照品i濃度［4］。結(jié)果見表9。

2.4.2 耐用性考查 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，分別考查不同型號色譜儀和不同型號色譜柱對相對校正因子的影響。結(jié)果表明不同高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子無顯著影響（RSD＜3%），見表10。

表10 不同儀器和不同色譜柱待測成分的相對校正因子

2.4.3 色譜峰定位 以內(nèi)參物黃芩苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，采用相對保留時間值法對待測目標(biāo)成分色譜峰進(jìn)行定位，分別計(jì)算待測成分綠原酸、芒果苷、牛蒡苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的相對保留時間（RRT）。計(jì)算公式：r=tRi/tRs，tRi為待測物i的保留時間，tRs為內(nèi)參物s的保留時間。考查各待測成分RRT在不同高效液相色譜儀和色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果表明各待測成分RRT波動較?。≧SD＜3%），表明用相對保留時間法對色譜峰定位是可行的，見表11。

表11 不同儀器和不同色譜柱待測成分的相對保留時間

2.4.4 樣品含量測定 取3批金花清感顆粒按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算樣品中綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷及甘草酸銨的含量，結(jié)果見表12。將2種方法計(jì)算結(jié)果經(jīng)相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果2種方法之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，2種方法計(jì)算得含量結(jié)果基本一致，t檢驗(yàn)結(jié)果表明P＞0.05，表明2種方法計(jì)算結(jié)果無顯著性差異。

表12 金花清感顆粒6種成分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分及內(nèi)參物的選擇 根據(jù)處方組成，通過查閱藥典及文獻(xiàn)，本文對金花清感顆粒中可能含有的成分的麻黃堿、苦杏仁苷、綠原酸、木犀草苷、芒果苷、連翹酯苷A、連翹苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、貝母素甲、貝母素乙、甘草苷及甘草酸銨等成分進(jìn)行了考查和篩選。根據(jù)各指標(biāo)的峰型、分離度、響應(yīng)值及在樣品中的含量等為評價指標(biāo)，最終選擇了其中含量和響應(yīng)值均較高且具有一定代表性的6個指標(biāo)成分進(jìn)行后續(xù)測定。其中，黃芩苷在6各成分中含量最高，出峰時間位于色譜圖中位，在譜圖中最易識別，且黃芩苷穩(wěn)定易得，故選擇黃芩苷為內(nèi)參物。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 本文考查了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同洗脫系統(tǒng)，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液時，各峰峰形、分離度以及色譜圖基線平穩(wěn)情況均較好。紫外掃描發(fā)現(xiàn)6種成分的吸收波長存在較大差異，單一波長下難以同時檢測。故采用254 nm（檢測芒果苷、甘草酸銨）、277 nm（檢測黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷）和327 nm（檢測綠原酸）3個波長進(jìn)行檢測。

3.3 供試品溶液的制備方法考查 比較了不同提取方式（超聲和回流）、不同溶劑（乙醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇）、不同提取時間（10、20、30、40和60 min）以及溶劑量（10、20、30、40和50 ml）對色譜峰響應(yīng)值的影響，最終確定了供試品溶液的制備方法。

綜上所述，本文建立了一測多評法同時測定金花清感顆粒中6種成分綠原酸、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的含量，與外標(biāo)法所測結(jié)果無明顯差異，該方法簡便、重復(fù)性好，可為金花清感顆粒的質(zhì)量控制提供參考，同時可降低多組分質(zhì)量控制的檢測成本。

1北京市中醫(yī)管理局.北京中醫(yī)藥科學(xué)防治甲型H1N1流感—“金花清感方”新藥研發(fā)紀(jì)實(shí)［J］.北京中醫(yī)藥，2009，28（12）：981.