郝桂明，王玉霞，王 衛(wèi)

（天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070）

匹多莫德(pidotimod)是一種免疫調(diào)節(jié)劑，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于二肽［1］，因?yàn)榫哂携熜э@著、耐受性好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于免疫功能低下的人群。匹多莫德口服液于1993年由普利化學(xué)工業(yè)公司在意大利上市，臨床上主要用于反復(fù)發(fā)作感染和急慢性感染的輔助治療［2-3］。目前，匹多莫德口服液在國(guó)內(nèi)外藥典中均未見(jiàn)收載，現(xiàn)行的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中也未對(duì)其特異性雜質(zhì)進(jìn)行控制。筆者采用RP-HPLC-外標(biāo)法對(duì)匹多莫德口服液中的L-噻唑烷-4-羧酸含量進(jìn)行測(cè)定，可有效地控制其質(zhì)量，方法準(zhǔn)確度高、靈敏性好、結(jié)果可靠。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號(hào)：安捷倫1260，包括PDA檢測(cè)器、Open-lab CDS色譜工作站）；METTLER XS205電子天平（梅特勒公司）。

1.2 試藥 匹多莫德口服液（江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；批號(hào)2015020201、2017081408、2017092518）；L-噻唑烷-4-羧酸對(duì)照品（EUTICAL S.p.A公司提供，批號(hào)08/0701，純度：99.5%）。甲醇、異丙醇均為色譜純（天津市康科德），磷酸二氫鈉為分析純（阿拉丁化學(xué)試劑），水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱采用Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用85%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5），流動(dòng)相B為甲醇-異丙醇（2∶1），按表1程序進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μl。

表1 梯度洗脫程序表

2.2溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 精密量取本品適量（約相當(dāng)于匹多莫德25 mg），置50 ml量瓶中，加溶劑［0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用85%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）-甲醇-異丙醇（97∶2∶1）］適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密量取L-噻唑烷-4-羧酸對(duì)照品10 mg，置20 ml量瓶中，加溶劑使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，量取1.0 ml，置100 ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取本品適量（約相當(dāng)于匹多莫德50 mg），置100 ml量瓶中，加入3%過(guò)氧化氫溶液3 ml，振搖，室溫放置15 min，加入對(duì)照品貯備液1.0 ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。分別精密量取系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液（A）對(duì)照品（B）供試品（C）HPLC色譜圖

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

2.4.1 空白輔料溶液 取混合好的空白輔料5 ml，置200 ml量瓶中，用適量溶劑振搖使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得，結(jié)果表明（見(jiàn)色譜圖2A），空白輔料無(wú)干擾。

2.4.2 酸破壞樣品溶液 精密量取本品5 ml（批號(hào)2015020201），置200 ml量瓶中，加4 mol/L鹽酸溶液20 ml，超聲振蕩15 min，在室溫放置4 h后，用4 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 堿破壞樣品溶液 精密量取本品5 ml（批號(hào)2015020201），置200 ml量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 ml，超聲振蕩15 min，在室溫放置3 h，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.4 氧化破壞樣品溶液 精密量取本品5 ml（批號(hào)2015020201），置200 ml量瓶中，加5 ml溶劑使溶解，加30%過(guò)氧化氫溶液1 ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，在室溫放置2 h后，濾過(guò)，即得。

2.4.5 高溫破壞樣品溶液 精密量取本品5 ml（批號(hào)2015020201），置200 ml量瓶中，加溶劑適量振搖使溶解，80℃水浴加熱4 h，放冷至室溫，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4.6 光照破壞樣品溶液 精密量取本品5 ml（批號(hào)2015020201），置200 ml量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。樣品溶液在日光下放置14 d，濾過(guò)，即得。

分別精密量取上述空白輔料溶液及各破壞條件下的樣品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明，經(jīng)上述條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物與L-噻唑烷-4-羧酸峰均能達(dá)到完全分離。

圖2 空白輔料（A）酸破壞（B）堿破壞（C）氧化破壞（D）高溫破壞（E）光照破壞（F）HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考查 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，采用逐步稀釋法，用溶劑稀釋使成梯度濃度。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄L-噻唑烷-4-羧酸峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。線性方程為Y=2.020X＋0.135（r=0.999 5，n=9），線性范圍為0.54～16.10 μg/ml。

2.6 檢測(cè)限與定量限考查 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用溶劑逐步稀釋濃度，記錄色譜圖。以S/N為3∶1計(jì)算檢測(cè)限，以S/N為10∶1計(jì)算定量限。檢測(cè)限和定量限分別為2.7和10.7 ng。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄L-噻唑烷-4-羧酸峰面積，RSD為1.3%，表明本方法精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下的方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，L-噻唑烷-4-羧酸峰面積的RSD為1.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下制備的供試品溶液，在室溫條件下分別放置0、6、12和24 h后進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，L-噻唑烷-4-羧酸有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，故供試品溶液須臨用新制。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知L-噻唑烷-4-羧酸含量的匹多莫德口服液（批號(hào)2015020201）5 ml，共6份，分別置200 ml量瓶中，加溶劑適量使溶解，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液2 ml，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄L-噻唑烷-4-羧酸的峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為101.73%，RSD為0.52%，見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.11 樣品的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 取匹多莫德口服液3批（批號(hào)2015020201、2017081408、2017092518），按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算L-噻唑烷-4-羧酸含量。3批樣品測(cè)定結(jié)果分別為1.11%、0.65%和0.56%。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 筆者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［4］，采用現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的等度洗脫方法進(jìn)行匹多莫德口服溶液有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)，在相對(duì)保留時(shí)間為0.24處出現(xiàn)一個(gè)色譜峰，雖然該色譜峰與L-噻唑烷-4-羧酸對(duì)照品的保留時(shí)間一致，但并非同一物質(zhì)。若將該色譜峰歸屬為L(zhǎng)-噻唑烷-4-羧酸，因其校正因子較大（f=10.18），會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果造成誤判。當(dāng)將流動(dòng)相改為純水相（0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液，用85%磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5）時(shí)，該色譜峰分離為3個(gè)色譜峰，分別為L(zhǎng)-噻唑烷-4-羧酸和兩個(gè)氧化降解雜質(zhì)，但在純水相的色譜條件下，主成分在色譜柱中保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（tR＞60 min），而且對(duì)色譜柱的要求較高。采用本方法的梯度洗脫色譜條件，L-噻唑烷-4-羧酸峰和氧化降解雜質(zhì)峰能達(dá)到完全分離，同時(shí)主成分能夠在15 min左右快速洗脫，可以滿足匹多莫德口服液中L-噻唑烷-4-羧酸含量測(cè)定的要求。

3.2 限度的確定 現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下只規(guī)定了雜質(zhì)總量不得過(guò)2.0%，未規(guī)定特異性雜質(zhì)和其他單個(gè)雜質(zhì)的限度。匹多莫德口服液與匹多莫德原料及其他制劑相比較，L-噻唑烷-4-羧酸及兩個(gè)氧化降解雜質(zhì)的含量明顯增加。L-噻唑烷-4-羧酸急性毒性較低，人體經(jīng)口服的最低中毒劑量為420 mg/kg，主要毒副作用為嗜睡、震顫和腎功能低下。并且匹多莫德口服液自上市以來(lái)，產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定，不良反應(yīng)較少?；谏鲜鲈?，將限度規(guī)定為L(zhǎng)-噻唑烷-4-羧酸不得過(guò)1.0%。

綜上所述，采用筆者建立的RP-HPLC法測(cè)定匹多莫德口服液中L-噻唑烷-4-羧酸的含量，方法靈敏度、準(zhǔn)確、可靠，可有效控制匹多莫德口服液的質(zhì)量。