吳 拮，王 棟，李 靜，趙成相

（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科研究所，陜西 西安 710032）

含有鈣鹽的組織是一種堅硬的結(jié)締組織，如骨組織，其基質(zhì)中含有大量固定的無機(jī)鹽，必須脫鈣除去骨鹽才可進(jìn)行冷凍切片和石蠟切片，因此在制作病理切片過程中，常常需要經(jīng)過脫鈣處理，才能進(jìn)行切片染色[1]。而選擇合適的切片法至關(guān)重要，常規(guī)石蠟包埋切片，制作過程時間長，在制作過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯和包埋劑有機(jī)溶劑處理，對組織抗原有一定的損害及遮蔽，使組織內(nèi)抗原活性發(fā)生改變。脫鈣稍不徹底，部分標(biāo)本切片出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象，易出現(xiàn)“刀痕”，水浴鍋攤片過程易散爛。冷凍切片操作快捷，染色過程簡便，還可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。近年來的研究對椎間盤退變的機(jī)制研究更加深入，不僅要求有常規(guī)的組織結(jié)構(gòu)化學(xué)染色，更要保留組織的免疫原性，因此冷凍切片的優(yōu)勢非常適合應(yīng)用到研究椎間盤的過程。下面我們將對椎間盤骨組織進(jìn)行冷凍切片具體操作過程進(jìn)行深入探討。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本來自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科動物實驗中心提供的大鼠。取大鼠尾椎標(biāo)本，在4%多聚甲醛固定液（Beyotime，P0099）固定48 h，投入10%EDTA 脫鈣液（西安赫特生物科技公司）中，置于陰涼通風(fēng)處中持續(xù)脫鈣。儀器：恒溫式冷凍切片機(jī)（德國Leica，M1850）。試劑：OCT 冷凍切片包埋劑，蔗糖。

1.2 方法 脫鈣及脫鈣終點標(biāo)本用脫鈣液在常溫通風(fēng)下進(jìn)行脫鈣，每間隔3 d 更換1 次脫鈣液，當(dāng)用手術(shù)縫針輕松無阻力穿過組織或可用手術(shù)刀輕力切開即為脫鈣完成。流水沖洗30 min 后，投入30%蔗糖溶液中脫水，蔗糖會逐漸滲透入細(xì)胞間，并增加組織的比重，所以組織間隙被蔗糖填充后一定會沉底的，將其取出，并用濾紙吸去多余液體。利用高滲蔗糖溶液是減少組織含水量，降低冷凍切片時組織中冰晶的產(chǎn)生。

1.3 切片 ①先將冷凍切片機(jī)冷臺啟動預(yù)冷，切片時，冷凍室溫度在-18 ℃～-22 ℃；②將椎體組織切成大小適宜的組織塊；③滴加少許OCT 包埋液在組織托上，待冷凍后修平，將組織放置于修平的面上，用OCT 液包埋，置于冷臺上冷凍5～10 min；④冷凍切片厚度為6～8 μm，直接貼于掛膠載玻片上。

1.4 染色

1.4.1 HE 染色 使用蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒染色。冷凍切片PBS 潤洗，入蘇木精染液3 min，水洗2 min，用1%鹽酸乙醇分化15 s，水洗2 min，稀氨水返藍(lán)1 min，水洗2 min，80%乙醇1 min，伊紅2 min，水洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4.2 番紅O 染色（saframin o stain）索萊寶公司改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒染色。切片水洗，Weigert 染液染色3 min，流水沖洗1 min。酸性分化液分化5 s，水洗10 min，固綠染色5 min，弱酸洗滌10 s，滴加Safranin O 染液內(nèi)浸染5 min。95%酒精，無水酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4.3 免疫熒光染色 從冰箱取出切片，在室溫下進(jìn)行復(fù)溫。使用PBS 清洗2 遍；用免疫染色強(qiáng)力通透液打孔15 min，PBS 清洗3 次；封閉液封閉，室溫孵育30 min，傾去勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（Aggreacan，髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，Millipore 公司，AB1031，使用1∶100 稀釋），4 ℃過夜，PBS 清洗；滴加一定比例稀釋的熒光標(biāo)記的二抗（本例選取了1∶200 的FITC 標(biāo)記的抗兔二抗），37 ℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 遍；用含DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色和番紅O 染色 HE 染色和番紅O 染色切片顯示，椎間盤結(jié)構(gòu)完整，整個髓核組織清淅可見，纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)相對完整，軟骨終板的軟骨樣結(jié)構(gòu)和椎體的骨性結(jié)構(gòu)區(qū)分明顯，見圖1、圖2。

圖1 HE 染色

圖2 番紅O 染色

2.2 免疫熒光染色 結(jié)果顯示，椎間盤組織的免疫原性保存較好，抗體著色均勻，特異性較強(qiáng)，見圖3。不論是常見的化學(xué)染色還是免疫熒光染色，冷凍切片均顯示出對椎間盤組織較好的染色效果。

圖3 免疫熒光

3 討論

脫鈣是利用化學(xué)或物理方法，將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維進(jìn)行分離“除去鈣鹽”，使骨組織軟化，目的是獲得完整的骨切片。選擇脫鈣液是制作骨切片的重要環(huán)節(jié)，即要切出完整的切片，又要能完整的保存骨組織內(nèi)部成分的完整性。對組織內(nèi)的酶、抗原都有一定保護(hù)作用。否則脫鈣過度或不足會影響染色效果，嚴(yán)重影響結(jié)果的判讀。固定和脫鈣的時間不宜過長，且盡量保持在相對陰冷的環(huán)境中，避免組織免疫活性的喪失[2，3]。脫鈣時間過短，容易造成切片過程中椎間盤髓核和纖維環(huán)的組織結(jié)構(gòu)分離和纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)的破壞，在研究椎間盤退變過程中，容易和纖維環(huán)穿刺退變模型引起的纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞相混淆。冷凍切片是一種借助低溫環(huán)境，使組織在短時間內(nèi)達(dá)到一定硬度而進(jìn)行切片的方法。由于冷凍切片比石蠟切片相對省時且能較好地保護(hù)抗原活性，在科學(xué)研究中，特別是在進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色實驗比較適用。

本實驗中椎間盤骨組織通過冷凍切片法，制作能夠較好地保存細(xì)胞抗原的活性，并最大程度的保留了椎間盤的組織結(jié)構(gòu)。在操作的過程中減少了對組織脫水、包埋等中間環(huán)節(jié)，在科研實驗的免疫組化染色中的應(yīng)用中有著不可取代的地位，因此在科研以及臨床工作中的應(yīng)用較為廣泛。同時，冷凍切片的容錯率較高，可以對短時間內(nèi)脫鈣的樣本進(jìn)行試切，如脫鈣不徹底，其余組樣本可以從脫水狀態(tài)再次進(jìn)入脫鈣液中，相較于石蠟切片方法更為簡便。本例中外層的纖維環(huán)外圍有輕微的損壞，而大部分外層纖維環(huán)內(nèi)層纖維環(huán)和髓核結(jié)構(gòu)保留非常完整，尤其是纖維環(huán)的板層結(jié)構(gòu)和纖維走行非常清晰，判斷主要原因是組織取材固定前，對周圍軟組織剝離過多造成的物理損傷，并非是切片過程中產(chǎn)生的誤差。因此，在以后的大鼠椎間盤取材過程中，盡量保持組織結(jié)構(gòu)的完整性，不能為達(dá)到快速脫鈣的目的而過度剝離外周組織[4，5]。

在整個制作過程中應(yīng)注意以下幾點：①取材時刀片要鋒利，組織塊不易過長；②脫鈣液要充足，一般為標(biāo)本體積的20 倍，3 d 換1 次脫鈣液，脫鈣時將瓶口不要蓋嚴(yán)，在通風(fēng)處放置，縮短脫鈣時間；③切片時溫度很重要，溫度過低容易導(dǎo)致組織過硬，切片易碎，溫度過高則由于組織硬度不夠，切片不成形，產(chǎn)生搓板狀或粉末狀；④切片時刀要鋒利，最好是一次性刀片，不要有劃痕；⑤染色時特點注意水洗步驟，流水沖洗時不要對著組織沖洗，以免脫片[6-8]。

綜上所述，通過本實驗說明冰凍切片在研究椎間盤相關(guān)課題的應(yīng)用中有很好的應(yīng)用前景，在最大保留抗原性的同時也極好的保護(hù)了組織結(jié)構(gòu)的完整性，對未來椎間盤相關(guān)實驗的組織切片選擇提供了指導(dǎo)意義。