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        益生菌干預(yù)肝臟組織DAG-PKC的表達對肥胖小鼠胰島素抵抗的影響*

        2021-07-29 06:22:38易嘉岱常向云王曉麗程運杰
        醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年8期
        關(guān)鍵詞:胰島素小鼠水平

        易嘉岱,常向云,王曉麗,程運杰

        (1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝科,石河子 832002;2.浙江省立同德醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝科,杭州 310012)

        肥胖是一種常見病,屬于世界性公眾健康問題,當(dāng)機體的能量消耗遠小于攝入時便會導(dǎo)致體脂沉積,從而造成體質(zhì)量增加[1],臨床上定義身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≥30 kg·(m2)-1為肥胖[2]。研究顯示糖尿病、冠心病的患病風(fēng)險會隨著BMI的增加而增加[3],因此肥胖不僅對人類的身體健康帶來傷害,也給社會經(jīng)濟的發(fā)展以及醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的負擔(dān)。肥胖是引起胰島素抵抗(IR)的主要潛在原因[4]。肥胖引起IR的機制可能與胰島素信號通路受損、糖脂代謝紊亂、慢性炎癥以及氧化應(yīng)激有關(guān)[5]。近年來多個研究顯示二酰甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)與IR有關(guān),在多種包括飲食介導(dǎo)的肥胖大鼠和肥胖人群、輸注葡萄糖或2型糖尿病的嚙齒動物模型中發(fā)現(xiàn),當(dāng)存在IR狀態(tài)時,機體內(nèi)的DAG、PKC含量增加,且PKC的分布、活性也發(fā)生了改變[6]。DAG是PKC的生理激活因子,當(dāng)循環(huán)中血糖升高時,DAG主要依賴于從頭合成磷脂,DAG的含量增加,PKC的活性及分布發(fā)生改變,使得DAG-PKC通路的活性升高,引起胰島素受體的磷酸化和下調(diào)[10],這一過程導(dǎo)致了脂質(zhì)代謝紊亂和IR。益生菌作為微生態(tài)制劑,在維持腸道菌群的平衡方面起著重要作用[8]。多項研究顯示腸道菌群失調(diào)與肥胖等多種慢性疾病相關(guān)[9]。補充益生菌可改善2型糖尿病的IR狀態(tài)[10],但相關(guān)的機制暫不明確。故本研究旨在通過研究益生菌干預(yù)飲食介導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟組織中 DAG、 PKC的表達情況,進一步探討益生菌對改善脂代謝及IR的可能機制。為肥胖及IR的預(yù)防和治療提供新的思路及理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1實驗動物 C57BL/6N雄性野生型小鼠60只,5周齡,無特定病原體(SPF)級,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)-2016-0006],平均體質(zhì)量(19±1.0) g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有小鼠分籠飼養(yǎng)于清潔動物房,每籠 5只,保持溫度在17~21 ℃,相對濕度保持在約50%,每日光照12 h。

        1.1.2主要試劑和儀器 DAG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL18401);PKC酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,批號:JL13990);磷酸鹽緩沖液(Biosharp公司,批號:69010707)(pH值7.4);小鼠飼料均購于華雅思創(chuàng)生物科技有限公司(高脂飼料,批號:D12492;普通飼料,批號:D12450B);益生菌VSL#3購于美國VSL公司(V1209-0917)(成分包括乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬);血糖儀和血糖試紙(Roche,德國);酶標(biāo)儀(Molecular Devices,美國) ;全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Roche,德國)。

        1.2方法

        1.2.1實驗分組及VSL#3干預(yù) C57BL/6N雄性野生型小鼠60只,采用配對比較法進行隨機分為2組,正常脂肪飲食(NFD)30只給予普通飼料(脂肪熱卡占10%),高脂肪飲食(HFD)30只給予高脂飼料(脂肪熱卡占 60%),飼養(yǎng)8周后,將兩組小鼠稱質(zhì)量并記錄其體質(zhì)量(WT),評估造模結(jié)果,HFD組小鼠體質(zhì)量相較于NFD組小鼠平均體質(zhì)量增加20%定義為肥胖小鼠[11]。將造模成功的肥胖小鼠及NFD組小鼠分別隨機分為活性益生菌干預(yù)(VSL#3)、滅活益生菌干預(yù)(滅活VSL#3)、空白對照(等量純化水)繼續(xù)干預(yù)4周。VSL#3劑量及給藥方式:參照人的口服劑量換算出小鼠所需VSL#3為1.2 g·kg-1·d-1;以每只小鼠體質(zhì)量20 g計算,VSL#3的劑量約為每只24 mg·d-1,溶于普通純化水,每日一次灌胃;滅活益生菌干預(yù)組將VSL#3溶于60 ℃ 熱純化水中滅活后,同等劑量灌胃??瞻讓φ战M予以等量蒸餾水灌胃。

        1.2.2血糖、血脂檢測 干預(yù)結(jié)束后,所有小鼠空腹8 h,內(nèi)眥靜脈采血,抗凝管收集小鼠靜脈血,靜置30 min,3000 r·min-1(r=10 cm),離心5 min,取上清液,采用化學(xué)發(fā)光法測量空腹胰島素(FINS),酶比色法測量三酰甘油(TG)、膽固醇(TC);胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR(insulin resistance index,IRI),IRI=INS(mU·L-1)×FBG(mmol·L-1)/22.5。

        1.2.3標(biāo)本制備及ELISA 干預(yù)結(jié)束后,所有小鼠禁食8 h,稱定質(zhì)量并記錄,處死小鼠,在無菌環(huán)境下打開腹腔,摘取肝臟,放入無菌凍存管,并取小鼠肝臟組織(50±5)mg,進行稱定質(zhì)量并記錄,加入1000 μL的磷酸鹽緩沖液,用干燥無菌玻璃研磨器將肝臟標(biāo)本研磨充分,研磨好的組織勻漿轉(zhuǎn)入 1.5 mL EP管內(nèi),4 ℃,3000 r·min-1(r=10 cm),離心20 min,小心吸取上清液轉(zhuǎn)入另一新EP管中,備用。

        向預(yù)先包被相關(guān)抗體的酶標(biāo)孔中依次分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋后的待測樣本,再依次加入酶標(biāo)試劑,使其形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物,隨后將酶標(biāo)包被板置于37 ℃溫箱中溫育60 min,經(jīng)過5次充分洗滌未結(jié)合的成分,再分別向每孔中先后加入顯色劑,置于37 ℃溫箱中避光溫育15 min后,向每孔加入終止液,終止反應(yīng)后15 min內(nèi)上機檢測,以空白孔調(diào)零,450 nm波長測定各反應(yīng)孔的吸光度(A值),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其對應(yīng)的A值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各孔的濃度,再乘以樣本稀釋濃度后得出每個樣品DAG、PKC的濃度。

        2 結(jié)果

        2.1肥胖小鼠模型制備結(jié)果 高脂飼養(yǎng)8周后,HFD組小鼠體質(zhì)量每只為(32.91±0.25) g,NFD組體質(zhì)量每只為(26.80±0.21) g,HFD組小鼠平均體質(zhì)量相較于NFD組小鼠平均體質(zhì)量增加20%,造模成功率為100%。

        2.2益生菌對小鼠體質(zhì)量、糖代謝指標(biāo)及IR的影響 在益生菌干預(yù)第4周末,對小鼠的體質(zhì)量及糖代謝水平進行評估。在給予相同活性益生菌干預(yù)的條件下,HFD各組較NFD各組小鼠具有較高水平的體質(zhì)量、FBG、FINS及HOMA-IR水平(P<0.05);經(jīng)過益生菌干預(yù),VSL#3+HFD組的體質(zhì)量、FBG、FINS及HOMA-IR水平相較與HFD空白對照組及滅活VSL#3+HFD組明顯降低(P<0.05);HFD空白對照組與滅活VSL#3+HFD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);VSL#3+NFD組體質(zhì)量、糖代謝水平及HOMA-IR較NFD空白對照組及滅活VSL#3+NFD組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

        2.3益生菌對小鼠脂代謝水平的影響 益生菌干預(yù)4周后,檢測各組小鼠血TC、TG水平。在相同活性的益生菌干預(yù)條件下,HFD各組TC、TG水平較對應(yīng)的NFD各組小鼠升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)過益生菌干預(yù)后,VSL#3+HFD組相較于HFD空白對照組小鼠以及滅活VSL#3+HFD組小鼠的TC、TG水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而滅活VSL#3+HFD組與HFD空白對照組比較水平稍低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);VSL#3+NFD組TC、TG水平與NFD空白對照組及滅活VSL#3+NFD組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        2.4益生菌對小鼠肝臟組織中DAG、PKC表達的影響 HFD各組較NFD各組小鼠肝臟組織中均具有較高水平的DAG、PKC,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)過活性益生菌干預(yù)后,VSL#3+HFD組DAG、PKC水平較HFD空白對照組及滅活VSL#3+HFD組均有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);HFD空白對照組與滅活VSL#3+HFD組之間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而VSL#3+NFD組較滅活VSL#3+NFD組及NFD空白對照組比較較其肝臟組織中DAG表達水平稍降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),PKC在NFD3組間的表達無明顯差異(P>0.05)。見表3。

        2.5代謝指標(biāo)與肝臟組織內(nèi)DAG及PKC的相關(guān)性分析 通過對各組小鼠體質(zhì)量的評估以及其TC、TG、FBG、FINS、HOMA-IR及肝臟組織中DAG、PKC水平的檢測,并以Pearson法行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示DAG與PKC表達呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05);DAG水平的升高與體質(zhì)量、FBG及HOMA-IR呈正相關(guān)(P<0.05);PKC水平的升高與TG、FBG、HOMA-IR呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

        3 討論

        2型糖尿病發(fā)病機制主要為IR。IR是指靶細胞(肝臟、骨骼肌等)對循環(huán)中正常水平的胰島素反應(yīng)性降低,導(dǎo)致糖脂代謝紊亂,進而引起了機體胰島素水平的升高[12]。目前已知引起IR有多個危險因素,包括吸煙、服用噻嗪類利尿藥、使用糖皮質(zhì)激素等,最關(guān)鍵的是肥胖[13]。肥胖主要是因為能量代謝失衡導(dǎo)致脂質(zhì)在體內(nèi)蓄積,而肝臟在機體能量代謝中有著重要的作用,同時肝臟也是重要的胰島素靶器官。正常狀態(tài)下,胰島素可促進肝臟脂肪的合成,抑制糖異生,脂肪酸與甘油骨架縮合形成TG,而當(dāng)營養(yǎng)攝入過剩時,脂肪酸向肝臟的輸送遠遠超過了脂肪氧化和TG的合成和儲存的速度,引起肝內(nèi)脂質(zhì)含量的凈增加,進而引起肝臟組織內(nèi)DAG含量增加,這是導(dǎo)致肝臟IR的主要原因[6-7]。DAG作為PKC的激活劑,既往在多項動物實驗中已證實了DAG-PKC通路在肥胖介導(dǎo)的IR中發(fā)揮著作用[6]。在一項對肥胖患者的研究中顯示,糖尿病(DM)較非DM患者細胞中DAG水平增加,同時伴隨著PKC的增加,DAG水平與胰島素敏感性呈負相關(guān)[14]。本實驗中,小鼠經(jīng)過高脂飼養(yǎng)后體質(zhì)量、TC、TG、FBG、HOMA-IR水平上升,提示小鼠經(jīng)過高脂喂養(yǎng)出現(xiàn)了肥胖與IR,這與既往研究一致[15]。進一步檢測顯示HFP各組小鼠肝臟組織中DAG、PKC水平增加,經(jīng)Pearson相關(guān)性分析提示DAG-PKC表達增加與IR的發(fā)生有正相關(guān)關(guān)系。

        表1 益生菌干預(yù)對高脂飲食小鼠WT、FBG、FINS及HOMA-IR的影響

        表2 益生菌干預(yù)對高脂飲食小鼠血脂的影響

        表3 益生菌干預(yù)對高脂飲食小鼠肝臟組織內(nèi)DAG、PKC表達的影響

        表4 代謝指標(biāo)與肝臟組織內(nèi)DAG及PKC的相關(guān)性分析

        益生菌作為一種微生物制劑,在調(diào)節(jié)機體腸道菌群的平衡方面起著重要作用。研究顯示腸道微生物群的變化可能在代謝疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]。既往多個研究中顯示,IR可通過短期內(nèi)高脂肪含量飲食干預(yù)引起,當(dāng)血糖異常升高時,腸道菌群在構(gòu)成上發(fā)生改變,因此高脂飲食不僅會改變腸道菌群組分,還可對肥胖患者/小鼠的能量代謝產(chǎn)生影響,而益生菌補充已被證明能改善肥胖或糖尿病等存在IR狀態(tài)的患者/小鼠的糖脂代謝水平[10,17]。在使用不同種類益生菌(嗜酸性乳桿菌、短雙歧桿菌)對高脂飲食飼養(yǎng)大鼠進行干預(yù)實驗中,結(jié)果顯示兩種益生菌都可改善IR相關(guān)指標(biāo),同時對大鼠的生長發(fā)育無干擾。并提出兩種益生菌在調(diào)脂、減重方面的作用相差不大,但在調(diào)節(jié)IR方面,前者則略差于后者[18]。益生菌補充可能是改善代謝健康和預(yù)防飲食誘導(dǎo)的IR和2型糖尿病的有效策略。本實驗中,在經(jīng)過活性VSL#3干預(yù)后肥胖小鼠糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)水平有所下降,肝臟組織中的DAG和PKC的表達降低,而滅活VSL#3+HFD組較HFD空白對照組無明顯變化;活性/滅活VSL#3干預(yù)對于普通飲食組小鼠的糖脂代謝指標(biāo)及肝臟組織中DAG、PKC變化則無明顯差異,這表明活性益生菌和DAG-PKC途徑在肥胖介導(dǎo)的IR發(fā)生中起重要作用,補充益生菌可緩解高脂飲食誘導(dǎo)的IR,這種機制可能與DAG-PKC信號通路降低有關(guān)。

        肥胖誘導(dǎo)代謝綜合征機制十分復(fù)雜,且多種機制之間可能存在著相互影響。本實驗通過飲食誘導(dǎo)肥胖,證實了肥胖可通過介導(dǎo)DAG-PKC信號通路引起IR及脂代謝的紊亂,進一步通過研究益生菌干預(yù)對IR的影響,驗證了活性益生菌可改善肥胖引起的IR及脂代謝紊亂,該機制可能與DAG-PKC信號通路有關(guān)。為益生菌對肥胖等代謝綜合征的影響及其相關(guān)機制提供了新的理論基礎(chǔ)和思路。但益生菌的種類繁多,且DAG、PKC存在多種分型,參與多種生理傳導(dǎo)活動,在今后的研究中,應(yīng)對不同亞型的DAG、PKC以及不同種類和劑量的益生菌進行深入研究。

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