胡晟，張小文

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科二病區(qū)，昆明 650101)

良性膽管狹窄(benign biliary strictures，BBS)最常發(fā)生于術后或長期炎癥反應之后，患者可能無癥狀，或僅出現(xiàn)肝功能異常，或伴有嚴重黃疸，甚至并發(fā)重癥膽管炎危及生命[1]。研究表明[2]，在膽管重建中成纖維細胞(fibroblast，F(xiàn)B)增殖明顯，F(xiàn)B在膽管瘢痕增生和BBS發(fā)展中起重要作用。FB可轉化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)，F(xiàn)B所分泌的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分能夠將大量Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ 型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)沉積，促進膽管瘢痕組織的形成，具有收縮特性的α-肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)進一步促進膽管組織瘢痕性攣縮，進而導致組織不斷纖維化，最終導致BBS形成[3]。同時，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號通路過表達同樣在BBS形成過程中起到至關重要的作用[4]。芹菜素(Apigenin)是一種常見的黃酮類化合物，存在于各種水果和蔬菜中，如：歐芹、洋蔥、蘋果和某些調味料。芹菜素由于其抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜、降血壓和抑制腫瘤增生作用而受到越來越多的關注[5]。芹菜素被證明可以抑制多種腫瘤細胞的生長，如：前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和白血病細胞等[6]。目前已經闡明了芹菜素抑制細胞生長的幾種機制，包括細胞周期阻滯、細胞相關蛋白表達異常和細胞凋亡的誘導等[7]。然而，筆者尚未見文獻報道芹菜素對人良性膽管瘢痕成纖維細胞(human benign bile duct scar fibroblasts，HBBDSF)的影響。筆者研究原代培養(yǎng)HBBDSF并鑒定，使用芹菜素干預細胞，觀察細胞內TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達及細胞增殖、遷移和凋亡水平的變化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人良性膽管瘢痕組織經過患者知情同意，由我院肝膽胰外科二病區(qū)提供。人皮膚成纖維細胞(HSF)、人胚肺二倍體細胞(HDM1)購自中國科學院昆明動物研究所細胞庫。芹菜素(Apigenin)(上海麥克林生化科技有限公司，批號：A800500，規(guī)格：100 mg，含量≥98%)；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)(Sigma公司，批號：D5796)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(批號：C0227)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)(批號：ST447)、胰酶細胞消化液(0.25%胰酶，含酚紅)(批號：C0203)、增強型CCK-8試劑盒(批號：C0041)、BeyoClickTMEDU-488細胞增殖檢測試劑盒(批號：C0071S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號：C1062S)購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗人Vimentin(批號：WL01960)、兔抗人Keratin(批號：WL03015)、兔抗人TGF-β1(批號：WL02998)、兔抗人α-SMA(批號：WLH3879)、兔抗人Collagen I(批號：WL0088)、兔抗人Collagen III(批號：WL03186)、兔抗人β-Actin(批號：WL01372)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(批號：WLA031)購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細胞的培養(yǎng)與鑒定 經手術獲得的硬化膽管使用無菌PBS溶液清洗5次，無菌精細眼科剪剪為1 mm3大小。將組織分散至T25細胞培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置入37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8]。分離純化成纖維細胞，細胞生長至85%時消化、傳代。利用細胞免疫熒光技術檢測細胞Vimentin及Keratin抗體的表達進行細胞鑒定[9]。陽性對照選用HSF細胞，陰性對照選用HDM1細胞。

1.2.2CCK-8法檢測細胞半數(shù)抑制率(IC50)及增殖抑制率 將細胞接種至96孔板，細胞數(shù)量1×103個·mL-1，預先配制不同濃度梯度的芹菜素溶液(5，10，20，40，80 μmol·L-1)。次日棄去培養(yǎng)液，加入各濃度的芹菜素溶液繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h。每孔中加入CCK-8溶液10 μL，1 h后于全波長自動酶聯(lián)免疫檢測儀(型號：SPECTROstar Nano，產地：德國BMG公司)測定450 nm處吸光度(A)值。使用GraphPad Prism 8繪制IC50曲線及計算IC50值；計算人膽管瘢痕成纖維細胞的生長抑制率：抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)÷對照組A值×100%。

1.2.3EDU-488法檢測細胞增殖情況 將細胞接種至24孔板，細胞數(shù)量5×103個·mL-1。次日，加入IC50濃度以下的芹菜素作為實驗組(10，20 μmol·L-1)，對照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日，向每孔中加入2X EDU工作液300 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。之后4%的多聚甲醛室溫固定15 min，再用含3%BSA的PBS洗滌3次，后加0.3% Triton X-100的PBS室溫培養(yǎng)15 min，洗滌后每孔中加入Click反應液100 μL室溫避光培養(yǎng)30 min，接著每孔加入Hoechst33342(1000X)染料500 μL室溫避光培養(yǎng)20 min。最后在全自動熒光顯微鏡(型號：EVOS M7000，產地：賽默飛世爾科技有限公司)下觀察并攝像記錄。細胞計數(shù)后，計算增殖細胞比率(%)=增殖細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%。

1.2.4細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況 將細胞接種至6孔板，細胞數(shù)量1×104個·mL-1。次日，使用無菌200 μL槍頭垂直于昨日所標記的黑線進行劃痕，PBS 1X清洗1～2次。加入IC50濃度以下的芹菜素作為實驗組(10、20 μmol·L-1)，對照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡(型號：EVOS XL CORE，產地：Thermo公司)下于0，6，12，24 h分別觀察并攝像記錄。得到原始圖片后使用Image J版軟件進行劃痕面積的定量計算。

1.2.5高速分析型流式細胞儀(型號：Attune Nxt，產地：賽默飛世爾科技有限公司)檢測細胞凋亡情況 將細胞接種至6孔板，細胞數(shù)量1×104個·mL-1。次日，加入IC50濃度以下的芹菜素作為實驗組(10，20 μmol·L-1)4 h以誘導凋亡，對照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。4 h后消化6孔板內細胞，制成細胞懸液轉移至流式上樣管中，再向流式上樣管中依次加入Annexin V-FITC結合液195 μL、Annexin V-FITC溶液5 μL、碘化丙啶染色液10 μL并輕輕混勻室溫避光染色15 min，立即上機檢測。

1.2.6免疫熒光法檢測細胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達情況 將細胞接種至96孔板，細胞數(shù)量1×103個·mL-1。次日，加入IC50濃度以下的芹菜素作為實驗組(10、20 μmol·L-1)，對照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。之后利用免疫熒光法檢測細胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達情況，在熒光顯微鏡下觀察并攝像記錄。

1.2.7Western blotting檢測細胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達情況 提取各組細胞總蛋白，采用BCA法檢測并計算蛋白濃度，以SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gel elextrophoresis，SDS-PAGE)凝膠進行電泳。使用聚偏 二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)轉膜，再行封閉處理，以1：5000比例稀釋一抗，置于4 ℃冰箱過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)磷酸緩沖液清洗PVDF膜3～5次。以1：5000比例稀釋二抗，并室溫孵育2 h，TBST磷酸緩沖液再次清洗PVDF 膜3～5次。β-actin作為內參，實驗條帶的灰度值采用Quantity one軟件進行處理分析。

2 結果

2.1HBBDSF的鑒定結果 原代培養(yǎng)的HBBDSF在光鏡下呈不規(guī)則三角形，隨之逐漸轉化為梭形的單核細胞，此時形態(tài)與成纖維細胞十分近似。原代培養(yǎng)的第5代HBBDSFD的Vimentin、Keratin均為強陽性表達(表現(xiàn)為強烈的綠色熒光)，鑒定成纖維細胞主要是根據細胞形態(tài)和Vimentin、Keratin抗體的細胞免疫熒光進行。根據細胞光鏡下形態(tài)及免疫熒光結果可證明此細胞為HDDBSF。陽性對照組(HSF)結果Vimentin陽性而Keratin陰性表達，陰性對照組(HDM1)均表達為陰性。詳見圖1～3。

2.2CCK-8法檢測芹菜抑制細胞IC50值及芹菜素對細胞增殖影響的結果 選取48 h的重復測量5次的吸光度(A)值進行IC50值計算芹菜素IC50=22.75 μmol·L-1，R2=0.797，見圖4。本研究后續(xù)實驗選擇的芹菜素藥物濃度均在IC50值以下(10，20 μmol·L-1)。20 μmol·L-1組在24，48和72 h時與10 μmol·L-1比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明芹菜素的干預濃度越高則對細胞增殖的抑制率也越高。圖4、見表1。

A.Vimentin(+)；B.Keratin(+)。

A.Vimentin(+)；B.Keratin(-)。

A.Vimentin(-)；B.Keratin(-)。

2.3EDU-488法檢測芹菜素對細胞增殖影響的結果 被綠色熒光染色的代表增殖細胞，未被綠色熒光染色的為正常細胞。該實驗顯示，與對照組比較，10，20 μmol·L-1組的細胞增殖百分比均降低(P<0.01)；相對于10 μmol·L-1組，20 μmol·L-1組的細胞增殖百分比降低(P<0.05)。見圖5，6。

2.4細胞劃痕實驗檢測芹菜素對細胞遷移影響的結果 使用面積表示細胞劃痕區(qū)域，該實驗顯示12 h和24 h中，與對照組比較，10，20 μmol·L-1組細胞遷移后剩余面積均升高(P<0.05)；相對于10 μmol·L-1組，20 μmol·L-1組的細胞遷移后剩余面積增大(P<0.05)。見圖7～10。

Log[C]代表芹菜素溶液(80，40，20，10，5 μmol·L-1)的對數(shù)值。

2.5流式細胞儀檢測芹菜素對細胞凋亡影響的結果 利用二、四象限細胞百分比進行單因素方差分析，與對照組比較，10，20 μmol·L-1組的細胞早晚期凋亡百分比均升高(P<0.05)；相對于10 μmol·L-1組，20 μmol·L-1組的細胞早晚期凋亡百分比升高(P<0.05)。見圖11，12。

表1 芹菜素對HBBDSF增殖的抑制率

2.6免疫熒光技術檢測芹菜素對細胞TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ 和Collagen Ⅲ 蛋白的表達情況的結果 免疫熒光實驗中綠色熒光代表陽性表達，且綠色熒光越強則表達越強，反之亦然。本例中，對照組細胞對TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白均表現(xiàn)出強烈的綠色熒光，10，20 μmol·L-1的芹菜素組均表現(xiàn)出較弱的綠色熒光。說明芹菜素作用下，細胞對4種蛋白表達均減弱。見圖13。

圖5 EDU-488法檢測芹菜素對細胞增殖抑制的熒光圖(×100)

①與對照組比較，t=13.412，16.263，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=4.930，P<0.05。

2.7Western blotting檢測芹菜素對細胞TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達情況的結果 經過芹菜素72 h刺激后，與對照組比較，10，20 μmol·L-1芹菜素組對TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白表達水平均降低(P<0.05)，進一步兩兩比較，隨著芹菜素濃度增高，抑制細胞4種蛋白表達能力越強(P<0.05)，詳見圖14。

3 討論

在膽管損傷及修復過程中，增生性瘢痕形成是不可避免的，在肝內外膽管中，增生性瘢痕的形成與BBS的發(fā)生發(fā)展密切相關[10]。FB在膽管損傷修復中有重要地位，它是由胚胎時期的間充質干細胞分化發(fā)育而形成的。組織損傷后，F(xiàn)B擴增并轉化成MFB，后者會分泌ECM，不斷攣縮并填補組織缺損。一般情況下，只要組織缺損能夠表皮化，F(xiàn)B和MFB凋亡的進程就會加快，而且ECM分泌會顯著減少，組織修復的過程就趨向終止；另外，如果FB和MFB不斷大量增生，同時ECM持續(xù)過量積累，則會逐漸形成增生性瘢痕，最終形成BBS[11]。

圖7 對照組細胞劃痕面積變化示意圖(×40)

圖8 芹菜素10 μmol·L-1組細胞劃痕面積變化示意圖(×40)

圖9 芹菜素20 μmol·L-1組細胞劃痕面積變化示意圖(×40)

①與對照組比較，t=-158.921，0.770，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=-49.676，8.059，P<0.05。

TGF-β1是一種具備多樣生物學效能的蛋白分子，是與膽管瘢痕形成最緊密的蛋白，它對于細胞的增生、組織瘢痕形成等病理生理過程起到了重要作用[12]。組織受到損傷后，F(xiàn)B和MFB中TGF-β1蛋白的表達量會顯著提高，并且TGF-β1積聚到一定量又能刺激FB大量增生，促使組織損傷后的修復系統(tǒng)激活[13]。TGF-β1重點是靠TGF-β1/Smads信號轉導通路繼而發(fā)揮其作用，抑制瘢痕組織和瘢痕FB中TGF-β1/Smads信號轉導通路的表達是目前治療瘢痕的主要手段之一[14]。

α-SMA表達為陽性為MFB特征性的標識，MFB同時具備FB和平滑肌細胞的特征，它有比較強的伸縮特性，也能分泌多量的ECM和調節(jié)ECM相關的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)[15]。FRANGOGIANNIS[16]發(fā)現(xiàn)，在膽管瘢痕組織中ECM特別是其中的CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白過量堆積，正常組織中MMPs和TIMPs可維持ECM的微環(huán)境以保持平衡，當組織受到損傷后MMPs和TIMPs的表達會不同于尋常，影響ECM的降解和代謝，導致其過量堆積，繼而形成瘢痕。膽管瘢痕FB和MFB中α-SMA的表達情況也受到TGF-β1含量的影響[17]。

圖11 流式細胞儀檢測芹菜素對細胞凋亡影響的散點圖

①與對照組比較，t=-13.254，-5.902，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=-4.685，P<0.05。

圖13 3組對TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白表達的免疫熒光圖(×200)

圖14 芹菜素對TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白表達的影響

①與對照組比較，t=4.531，35.961，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=6.029，30.898，P<0.05。

近年來，中藥及其衍生物在治療組織瘢痕中的應用已得到廣泛研究[18]。芹菜素具有抗腫瘤特性，并對一些慢性炎癥性疾病具有一定的療效。體外研究表明[19]，芹菜素可通過TGF-β1途徑抑制成纖維細胞的遷移，從而發(fā)揮治療哮喘和慢性鼻竇炎的作用。RICUPERO等[20]報道芹菜素通過抑制肺成纖維細胞的Akt途徑抑制成肌纖維細胞的增殖、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達，并降低TGF-β1誘導的α-SMA的表達。JUN等[21]證明在體外ECM重塑模型中，生理濃度的芹菜素抑制內皮素-1誘導的膠原蛋白凝膠收縮。在博來霉素誘導的系統(tǒng)性硬化小鼠模型中，芹菜素抑制博來霉素誘導的肺纖維化。然而，關于膽管瘢痕的研究很少。筆者首先通過體外實驗探討了芹菜素在膽管瘢痕成纖維細胞中的作用機制。本研究結果首次表明芹菜素可抑制細胞增殖和遷移，并可誘導細胞凋亡。且芹菜素可降低細胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達，芹菜素通過TGF-β1/Smads信號轉導通路影響HBBDSF的一系列生物學行為，但具體機制有待進一步研究。