劉豪杰 陳雪蕾

〔摘要〕 目的 探討蘆薈大黃素對胃癌SGC-7901細(xì)胞Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路及侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。方法 將復(fù)蘇后胃癌SGC-7901細(xì)胞分為空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組給予滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，對照組及實(shí)驗(yàn)組在空白組基礎(chǔ)上分別加入姜黃素40 μmol/L和蘆薈大黃素50 μmol/L培養(yǎng)，3組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h。采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移閉合率，采用Transwell小室檢測侵襲細(xì)胞個數(shù)，采用Western blot檢測上皮間質(zhì)化（EMT）相關(guān)蛋白E鈣黏蛋白（E-cad）、N鈣黏蛋白（N-cad）、波形蛋白（Vim）以及基質(zhì)金屬蛋白-9（MMP-9）、小窩蛋白-1（Cav-1）、PTEN磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB）信號通路的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕閉合率及侵襲細(xì)胞數(shù)均降低（P<0.05），Vim、N-cad、PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達(dá)降低（P<0.05），E-cad、Cav-1、PTEN蛋白表達(dá)升高（P<0.05）;與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕閉合率、侵襲細(xì)胞數(shù)及上述蛋白表達(dá)均無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 蘆薈大黃素可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制EMT及改善Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 蘆薈大黃素;胃癌細(xì)胞;SGC-7901;小窩蛋白-1;PTEN磷脂酰肌醇-3激酶;蛋白激酶B;遷移;侵襲

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.002

Effects of Aloe Emodin on Cav-1/PTEN/PI3K/PKB Signaling Pathway， Invasion and

Metastasis of Gastric Cancer SGC-7901 Cells

LIU Haojie， CHEN Xuelei

（Department of Gastroenterology， Ezhou Central Hospital， Ezhou， Hubei 436000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of aloe emodin on Cav-1/PTEN/PI3K/PKB signaling pathway， invasion and

metastasis of gastric cancer SGC-7901 cells. Methods After resuscitation， SGC-7901 cells were divided into blank group， control group and experimental group， the blank group was treated with MEM medium containing inactivated fetal bovine serum， on the basis of the blank group， the control group and experimental group were cultured with curcumin 40 μmol/L and aloe emodin 50 μmol/L， respectively. The three groups of cells were cultured for 24 hours. The migration and closure rate of cells was detected by scratch test， the number of invasive cells was detected by Transwell chamber， and the expression levels of epithelial mesenchymal transition （EMT） related proteins E-cadherin （E-cad）， N-cadherin （N-cad）， vimentin （Vim）， matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， caveolin-1 （Cav-1）， PTEN phosphatidylinositol-3 kinase （PI3K） and protein kinase B （PKB） signaling pathways were detected by Western blot. Results Compared with the blank group， the wound closure rate and the number of invasive cells in the control group and experimental group were decreased （P<0.05）， and the expression levels of Vim， N-cad， PI3K， PKB and MMP-9 protein were decreased （P<0.05）， while the expression levels of E-cad， Cav-1 and PTEN protein were increased （P<0.05）. Compared with the control group， there were no significant differences in wound closure rate， number of invasive cells and expression of the above proteins in the experimental group （P>0.05）. Conclusion Aloe emodin can inhibit the migration and invasion of gastric cancer SGC-7901 cells， and its mechanism may be related to the inhibition of EMT and the improvement of Cav-1/PTEN/PI3K/PKB signal pathway expression.

〔Keywords〕 aloe emodin; gastric cancer cell; SGC-7901; caveolin-1; PTEN phosphatidylinositol-3 kinase; protein kinase B; migration; invasion

胃癌由于其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為中、晚期，已延誤最佳治療時機(jī)，據(jù)報(bào)道，我國每年新發(fā)胃癌病例50萬，居惡性腫瘤發(fā)病率第3位[1]。因此，尋找多靶點(diǎn)、高效抗胃癌藥物是目前亟待解決的問題。蘆薈大黃素可從大黃和蘆薈中提取，已被證實(shí)有明顯的抗腫瘤作用，并且抗腫瘤靶點(diǎn)廣泛[2-4]。本團(tuán)隊(duì)在前期研究[5-6]中證實(shí)，蘆薈大黃素能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬及凋亡，并且使癌細(xì)胞生物學(xué)行為能力降低，雖然已對蘆薈大黃素抑制胃癌細(xì)胞增殖的部分機(jī)制進(jìn)行了探索，但該藥抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的機(jī)制尚不完全清晰。本研究基于前期研究結(jié)果，探索蘆薈大黃素抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移、增殖的深層機(jī)制，并采用姜黃素作為陽性對照藥物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑及儀器

胃癌細(xì)胞SGC-7901由廣西中醫(yī)藥大學(xué)陳文禮教授團(tuán)隊(duì)贈送。RPMI 1640培養(yǎng)基二甲基亞砜（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：s368d62、Z65482）;Transwell小室（北京沃凱生物科技有限公司，貨號：LM628Z727，批號2020305）;E鈣黏蛋白（E-cadherin， E-cad）、小窩蛋白-1（caveolin-1， Cav-1）、N鈣黏蛋白（N-cadherin， N-cad）一抗（英國Abcam公司，貨號：ab76319、ab2910、ab18203）;磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）、波形蛋白（vimentin， Vim）一抗（南京建成生物工程研究所，貨號：KF275、H233-3、KF685）;人第10號染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN）一抗（武漢艾美捷科技公司，貨號：PAB4118）;基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein， MMP-9）一抗（美國BioVision公司，貨號：3969-30T）。muLISKAN-MK3酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾公司）;Mini-Protean型小垂直板電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.2? 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

取SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇并接種于6孔板，細(xì)胞密度為4×103個/孔，培養(yǎng)至對數(shù)期。將細(xì)胞分為空白組、對照組及實(shí)驗(yàn)組，空白組細(xì)胞給予滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，對照組在空白組基礎(chǔ)上加入姜黃素40 μmol/L培養(yǎng)[7]，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在空白組基礎(chǔ)上加入蘆薈大黃素50 μmol/L培養(yǎng)[5-6]。

1.3? 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

取處于對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，接種并平鋪于6孔板中，注意調(diào)整細(xì)胞分布密度，每孔約接種5×105個細(xì)胞，用手輕搖6孔板，細(xì)胞分布均勻后平置于實(shí)驗(yàn)臺5 min，分組方法及加入藥物劑量同“1.2”項(xiàng)，放入細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞長滿后用移液器槍頭縱向劃線，加入PBS溶液清洗劃痕位置3次，繼續(xù)孵育24 h，取出后于光學(xué)顯微鏡下拍照，并應(yīng)用Image J軟件分析劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

劃痕閉合率=（劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h）/劃痕寬度0 h×100%

1.4? Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，用無菌血清將SGC-7901細(xì)胞調(diào)成細(xì)胞混懸液接種于6孔板中，分組方法及加入藥物同“1.2”項(xiàng)。再用無菌血清將Matrigel基質(zhì)膠稀釋為初始濃度的12.5%，取出Transwell小室，將稀釋后的基質(zhì)膠向每個小室注入30 μL，均勻鋪于底部，待30 min后基質(zhì)膠凝固，向每孔注入密度為1×104個/孔SGC-7901細(xì)胞，種于上層小室，下層小室沿壁緩慢注入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，在37 ℃條件下，放入細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中24 h，取出小室后用PBS溶液沖洗掉上層細(xì)胞，用4% Paraformaldehyde固定30 min，再用PBS溶液進(jìn)行清洗，加入結(jié)晶紫染色液，固定15 min后PBS溶液清漂去多余染色液，顯微鏡下拍照并計(jì)算細(xì)胞透膜數(shù)量（即為侵襲細(xì)胞數(shù)）。

1.5? Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平

取“1.2”項(xiàng)各組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞進(jìn)行裂解并制備成電泳上樣液，BCA法檢測上樣液濃度后計(jì)算具體上樣量，配制10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，切膠后用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉、洗膜后，孵育Vim、N-cad、E-cad、Cav-1、PTEN、PI3K、PKB及MMP-9一抗（均1∶1 000稀釋）過夜，次日經(jīng)洗膜后常溫下孵育二抗，時間為90 min，洗膜3次后用吸水紙吸干膜上多余液體，放入暗室內(nèi)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

目標(biāo)蛋白表達(dá)=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以“x±s”表示，滿足正態(tài)分布及方差齊性時，使用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布及方差齊性時使用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 蘆薈大黃素對SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響

對照組[（51.23±5.33）%]及實(shí)驗(yàn)組[（42.37±3.68）%]劃痕閉合率均低于空白組[（83.61±6.29）%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組劃痕閉合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.2? 蘆薈大黃素對SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響

對照組[（88.25±10.42）個]及實(shí)驗(yàn)組[（72.38±8.26）個]每視野下侵襲細(xì)胞數(shù)均低于空白組[（236.84±19.62）個]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.3? 蘆薈大黃素對SGC-7901細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，對照組及實(shí)驗(yàn)組Vim、N-cad表達(dá)降低，E-cad表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Vim、N-cad、E-cad蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3、表1。

2.4? 蘆薈大黃素對SGC-7901細(xì)胞Cav-1、PTEN、PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，對照組及實(shí)驗(yàn)組Cav-1、PTEN蛋白表達(dá)升高，PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組Cav-1、PTEN、PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖4、表2。

3 討論

人體胃部血供豐富，給胃癌細(xì)胞的生長、增殖提供了便利環(huán)境，導(dǎo)致胃癌發(fā)展迅速，且易轉(zhuǎn)移[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌患者的死因主要源于腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9]。已有研究[10]證實(shí)，腫瘤組織的大小及浸潤程度是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素，并且其對周圍組織浸潤深度的增加與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)性。因此，抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力有可能成為降低患者死亡率的有效方法。

中藥及中藥單體的抗腫瘤作用已成為目前的研究熱點(diǎn)之一，已有研究[11]顯示，姜黃素、白三草酮、黃芩素及白藜蘆醇均可抑制腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，并可通過多靶點(diǎn)及信號通路，降低腫瘤細(xì)胞的遷移能力。其中，姜黃素已被證實(shí)可通過抑制β-catenin/EMT，抑制腫瘤細(xì)胞遷移能力[12]，同時抑制JAK/STAT3信號通路，以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[13]，其抗腫瘤靶點(diǎn)與本研究主要內(nèi)容相似，故而將姜黃素作為本研究的陽性對照藥物。本團(tuán)隊(duì)在前期研究[6]中已證實(shí)，蘆薈大黃素濃度為50 μmol/L時是抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞生物學(xué)行為的最佳濃度，故而在本研究中繼續(xù)沿用。本研究中細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室證實(shí)，蘆薈大黃素可有效降低胃癌SGC-7901細(xì)胞劃痕閉合率及侵襲細(xì)胞數(shù)，說明其對SGC-7901細(xì)胞遷移能力和侵襲能力均具有較好的抑制作用。EMT是腫瘤細(xì)胞移行“種植”的第一步，當(dāng)EMT發(fā)生時，腫瘤細(xì)胞去除自己原有并未“發(fā)育”完全的上皮細(xì)胞特性，轉(zhuǎn)化為與“種植”處組織或器官相關(guān)的間充表型特征，獲得侵襲和遷移能力，隨著血液循環(huán)或體液循環(huán)，侵襲其他組織、器官，定植增殖，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端或近端轉(zhuǎn)移[14]。因此，EMT相關(guān)蛋白Vim、N-cad、E-cad也被視為腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移及侵襲的分子學(xué)水平標(biāo)記物。本團(tuán)隊(duì)通過Western blot檢測證實(shí)，蘆薈大黃素可有效降低SGC-7901細(xì)胞中Vim、N-cad表達(dá)，提高E-cad表達(dá)水平，從蛋白層面說明蘆薈大黃素對SGC-7901細(xì)胞侵襲及遷移能力具有抑制作用，這與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢相同。

小窩蛋白與脂類共同形成細(xì)胞質(zhì)膜小窩，對細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及信號調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用[15]。細(xì)胞質(zhì)膜小窩中Cav-1是主要支架蛋白，可橫跨細(xì)胞質(zhì)膜，同時對細(xì)胞外微環(huán)境刺激具有抵抗作用[16]。已有研究[17]證實(shí)，Cav-1是人體細(xì)胞中重要的抗癌蛋白之一，對腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)及腫瘤新生血管均有抑制作用。此外，Cav-1被證實(shí)與PTEN存在結(jié)合序列，是細(xì)胞質(zhì)膜PTEN表達(dá)水平的決定因素，二者共同發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用[18]。臨床研究[19]證實(shí)，PTEN在胃癌腫瘤組織中呈低表達(dá)，與腫瘤分期明顯呈負(fù)相關(guān)，從臨床角度說明PTEN的缺失可能是胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素。PI3K/PKB是PTEN下游的經(jīng)典信號通路，當(dāng)PTEN表達(dá)升高時，可使磷脂酰肌醇-3去磷酸化，從而使PI3K及PKB活性降低，抑制下游MMPs表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲的目的;另外，PTEN/PI3K/PKB信號通路與胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控均明顯相關(guān)，對于抑制胃癌細(xì)胞生長具有重要意義[20]。本研究通過Western blot檢測Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路及下游MMP-9蛋白表達(dá)，結(jié)果表明蘆薈大黃素可使SGC-7901細(xì)胞中Cav-1、PTEN表達(dá)升高，PI3K、PKB、MMP-9表達(dá)降低，說明Cav-1是蘆薈大黃素抑制胃癌細(xì)胞遷移的作用靶點(diǎn)之一，其可能通過提高Cav-1、PTEN表達(dá)，抑制PI3K/PKB通路蛋白及下游MMP-9蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞基質(zhì)的形成，改善腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，抑制SGC-7901細(xì)胞遷移能力及侵襲能力。本研究亦有不足之處，由于技術(shù)條件及經(jīng)費(fèi)的限制，并未對Cav-1其他下游信號通路采用相應(yīng)阻斷劑進(jìn)行干擾，結(jié)論的嚴(yán)謹(jǐn)性欠佳，本研究的不足之處，將在下一步研究中加以完善。

綜上所述，蘆薈大黃素可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞EMT及改善Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路表達(dá)有關(guān)。

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