李姍，黃允智，劉學(xué)英，傅向東,3

優(yōu)博專欄

作物氮肥利用效率遺傳改良研究進(jìn)展

李姍1，黃允智1，劉學(xué)英2，傅向東2,3

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095 2. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

氮素是植物生長發(fā)育所需的大量元素之一，施用氮肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高農(nóng)作物產(chǎn)量的重要手段。自20世紀(jì)60年代以來，“綠色革命”半矮稈農(nóng)作物品種的育成和大面積推廣有效地解決了“高產(chǎn)與倒伏”之間的矛盾，提高了農(nóng)作物的收獲指數(shù)和產(chǎn)量。然而半矮稈水稻和小麥品種也表現(xiàn)出生長發(fā)育對氮肥響應(yīng)減弱、根系對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收能力下降以及氮肥利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)低的弊病，其產(chǎn)量增加依賴于氮肥的大量投入，這不僅提高了種植成本還導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。因此，提高農(nóng)作物氮肥利用效率對于保障國家糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要戰(zhàn)略意義。本文概述了“綠色革命”與赤霉素的作用機(jī)理，系統(tǒng)總結(jié)了植物氮素吸收、同化和代謝調(diào)控方面的研究進(jìn)展，并介紹了提高作物氮肥利用效率的最新研究發(fā)現(xiàn)，以期為作物氮肥高效利用的遺傳改良提供參考。

水稻；綠色革命；氮肥利用效率；可持續(xù)農(nóng)業(yè)

自20世紀(jì)60年代以來，以半矮稈小麥(L.)和水稻(L.)等農(nóng)作物品種的培育和推廣為標(biāo)志的“綠色革命”帶來了全球糧食產(chǎn)量的飛躍，解決了由于人口快速增長而引發(fā)的糧食危機(jī)。水稻半矮稈基因()和小麥半矮稈基因()的應(yīng)用解決了因密植和大量施肥而導(dǎo)致的倒伏問題，提高了收獲指數(shù)，使作物單產(chǎn)大幅度提升。然而，半矮稈品種也伴隨著生長發(fā)育對氮肥響應(yīng)減弱、根系對氮素吸收能力下降以及氮肥利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)降低等問題[1]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)的數(shù)據(jù)顯示，在過去10年中，世界范圍的氮肥消耗量顯著增加，但糧食產(chǎn)量增速緩慢，氮肥的過量投入不但沒有大幅度地提高產(chǎn)量，反而導(dǎo)致了經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益的下滑。目前農(nóng)田氮肥利用效率僅為40.2%，大部分氮肥在土壤中累積，并隨著水土而流失進(jìn)江河湖海或經(jīng)過微生物反硝化作用排入大氣，這不僅浪費了資源和能源，還引起了土壤酸化、大氣和水體污染等一系列生態(tài)環(huán)境問題。因此，在保證產(chǎn)量不減的基礎(chǔ)上如何提高氮肥的利用效率，減少氮肥的使用量是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問題。

1 “綠色革命”與赤霉素的作用機(jī)理

“綠色革命”的分子本質(zhì)歸結(jié)于赤霉素(gibbe-rellic acid, GA)的生物學(xué)效應(yīng)。小麥“綠色革命”基因編碼赤霉素信號途徑的負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白，育種中應(yīng)用比較廣泛的和均編碼N端截斷突變形式的DELLA蛋白[2]，突變形式的DELLA蛋白本身不受GA誘導(dǎo)降解而積累，使小麥表現(xiàn)出半顯性的、GA不敏感的半矮化表型[3]。水稻“綠色革命”基因位于1號染色體的長臂上，編碼GA合成途徑的GA20氧化酶2 (GA20ox2)。在秈稻生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的是該基因缺失了383 bp的突變類型，突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，阻斷了GA53至GA20的合成過程，降低了水稻內(nèi)源活性GA的含量，使水稻DELLA蛋白SLR1 (SLENDER RICE 1)高水平積累，進(jìn)而導(dǎo)致水稻株高降低[4,5]。

DELLA蛋白為植物特有的GRAS家族(由最初發(fā)現(xiàn)的3個家族成員GAI、RGA和SCR的特征字母命名)的一個亞家族，是GA信號途徑的關(guān)鍵元件，在胞內(nèi)起到阻遏植物生長發(fā)育的作用[6～8]。GA信號首先被赤霉素受體蛋白GID1 (GIBBERELLIN- INSENSITIVE DWARF1)感知并與之結(jié)合[9]。GID1中存在一個可以結(jié)合GA的口袋和一個可延展的N端區(qū)域[10]，具有生物活性的GA與GID1結(jié)合后，GID1蛋白的N端區(qū)域就會蓋住口袋，然后與DELLA蛋白的TVHYNP結(jié)構(gòu)域互作形成GA-GID1-DELLA復(fù)合體[10,11]，進(jìn)一步使DELLA蛋白的GRAS結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，增強DELLA蛋白與F-BOX蛋白(SCFSLY1/GID2)的互作強度[12]，加速了DELLA蛋白的泛素化和26S蛋白酶體降解進(jìn)程。植物生長阻遏蛋白DELLA被降解后，釋放與其互作的轉(zhuǎn)錄因子，游離的轉(zhuǎn)錄因子啟動GA信號途徑相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長發(fā)育。DELLA蛋白N端的兩個保守結(jié)構(gòu)域DELLA和TVHYNP在擬南芥()、水稻、小麥、玉米(Linn.)和大麥(L.)等不同物種中高度保守。擬南芥基因組中的DELLA蛋白有5個成員，分別是GAI (GA-INSENSITIVE)、RGA (REPRESSOR OF)、RGL1 (RGA-LIKE1)、RGL2 (RGA-LIKE2)和RGL3 (RGA-LIKE3)。小麥綠色革命基因、玉米矮稈基因()、水稻和大麥()均為的直系同源基因[6,7,13,14]。

水稻生長調(diào)節(jié)因子OsGRF4 (growth-regulating factor 4)能與GIF1 (GRF-interacting factor 1)蛋白形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，該復(fù)合體可以直接結(jié)合多個氮代謝相關(guān)基因的啟動子，并促進(jìn)基因表達(dá)，從而促進(jìn)氮的吸收同化和轉(zhuǎn)運。而DELLA蛋白能與OsGRF4互作，并抑制OsGRF4-GIF1復(fù)合體的形成，進(jìn)而抑制了氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)[15]。()是一個控制水稻分蘗響應(yīng)土壤供氮水平變化的關(guān)鍵基因，其編碼一個AP2 (APETALA2)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。NGR5能夠招募PRC2復(fù)合體(polycomb repres-sive complex)并通過介導(dǎo)組蛋白H3K27m3甲基化修飾來調(diào)控水稻分蘗相關(guān)基因的表達(dá)。此外，基因表達(dá)受氮素調(diào)控，并且NGR5蛋白還是GA-GID1促進(jìn)的蛋白酶體降解的新靶標(biāo)。DELLA能與NGR5蛋白互作并與之競爭性結(jié)合GID1蛋白來抑制NGR5降解，從而促進(jìn)水稻分蘗增加[16]。

因此，“綠色革命”半矮稈的水稻和小麥因DELLA蛋白高水平積累而獲得了3個方面的特性：第一，DELLA蛋白的積累因抑制植物的生長而降低了株高，提高了抗倒伏能力；第二，高水平的DELLA蛋白抑制了OsGRF4對下游氮響應(yīng)因子的激活作用，降低了作物的氮肥利用效率；第三，高豐度的DELLA提高了NGR5蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)了植物分蘗，提高了產(chǎn)量。因此，半矮稈的水稻、小麥品種在高水肥條件下能保持其半矮化、抗倒伏和多分蘗等高產(chǎn)特性，但同時也降低了作物的氮素響應(yīng)和氮肥利用效率(圖1)。

2 植物的氮素吸收、轉(zhuǎn)運與同化

氮素是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，是體內(nèi)氨基酸和蛋白質(zhì)的重要構(gòu)成組分，其平均含量約占植物干重的1.5%。為了獲取充足的氮源以滿足生長發(fā)育的需要，植物根系需要從土壤中吸收不同形式的氮素，包括硝態(tài)氮(NO3?)、銨態(tài)氮(NH4+)、可溶性多肽和復(fù)雜的不溶性含氮化合物等，其中以吸收NO3?和NH4+為主。

2.1 NO3?的吸收和轉(zhuǎn)運

在通氣良好的旱田土壤中，植物主要以NO3?為氮源，植物根系吸收NO3?主要依靠硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(nitrate transporters, NRTs)來完成。從植物中分離鑒定出來的NO3?轉(zhuǎn)運體大致分為4類：NRT1/PTR (nitrate transporter 1/peptide transport family)、NRT2 (nitrate transporter 2)、CLC (chloride channel)和SLAC1/SLAH (slow anion channel/slow anion chan-nel homolog)。其中，大多數(shù)NRT1蛋白主要發(fā)揮低親和力NO3?轉(zhuǎn)運蛋白功能，但擬南芥AtNPF6.3/ AtNRT1.1、水稻OsNPF2.42和蒺藜苜蓿() MtNRT1.3例外；NRT2主要負(fù)責(zé)低濃度NO3?的轉(zhuǎn)運；CLC蛋白部分成員是液泡膜定位的NO3?/H+的逆向轉(zhuǎn)運蛋白，在液泡的NO3?積累方面發(fā)揮作用[17]；SLAC1/SLAH家族蛋白定位在保衛(wèi)細(xì)胞和根的中柱細(xì)胞，可能參與氣孔的關(guān)閉和NO3?從根到莖的運輸[17,18]。

在模式植物擬南芥中，有關(guān)NO3?吸收的分子機(jī)制研究比較深入。NRT1和PTR蛋白家族也被稱為NPF (NRT1 PTR family)[19]。除AtNPF6.3/AtNRT1.1/ AtCHL1外，擬南芥NPF家族成員均屬于低親和力轉(zhuǎn)運體。AtNPF6.3/AtNRT1.1/AtCHL1屬于雙親和力轉(zhuǎn)運體，在高濃度和低濃度的NO3?條件下均參與根系對NO3?的吸收，這主要取決于AtNRT1蛋白的第101位蘇氨酸是否發(fā)生磷酸化。當(dāng)T101位被磷酸化時，AtNPF6.3/AtNRT1.1作為高親和力的NO3?轉(zhuǎn)運體在低濃度NO3?的條件下發(fā)揮作用；當(dāng)T101位沒有被磷酸化時，AtNPF6.3/AtNRT1.1作為低親和力的NO3?轉(zhuǎn)運體在高濃度NO3?的條件下發(fā)揮作用[20]，在此過程中蛋白激酶CIPK23 (calcineurin B-like interacting protein kinase 23)感應(yīng)NO3?信號，能夠?qū)tNRT1.1進(jìn)行磷酸化修飾，進(jìn)而調(diào)控AtNPF6.3/ AtNRT1.1對NO3?的親和活性和吸收[21]。擬南芥NRT2家族至少有7個成員，其中6個成員發(fā)揮吸收NO3?的功能需要伴侶蛋白NAR2 (nitrate assimilation related protein 2)的存在，NRT2和NAR2家族成員均是NO3?高親和力運輸系統(tǒng)的組成部分[22,23]。

圖1 新“綠色革命”品種協(xié)同提升氮肥利用效率與產(chǎn)量

在厭氧條件下土壤中的氮素多以NH4+形式存在，但由于根系周圍發(fā)生的硝化作用，仍有大量的氮以NO3?的形式被作物吸收，因此NO3?對于水稻等喜銨作物也十分重要[24]。水稻中NO3?轉(zhuǎn)運蛋白大致可以分為低親和力轉(zhuǎn)運體OsNRT1和高親和力轉(zhuǎn)運體OsNRT2兩個家族，而OsNPF6.5 (OsNRT1.1B)和OsNPF6.1例外。編碼雙親和的NO3?轉(zhuǎn)運蛋白，受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)，在高、低NO3?濃度下都會發(fā)揮吸收NO3?的功能，高表達(dá)后可以顯著促進(jìn)根系對NO3?的吸收，增加株高、產(chǎn)量和籽粒的氮積累[25]。此外，能影響根系富集的、具有氮轉(zhuǎn)化能力的微生物組，從而改變根際微環(huán)境，進(jìn)而影響水稻的氮肥利用效率[26]。OsNPF6.1也是一個雙親和硝酸根轉(zhuǎn)運蛋白，定位于質(zhì)膜，在根部高表達(dá)，在硝酸鹽的吸收和再分配中發(fā)揮作用，并且受氮響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子OsNAC42的調(diào)控[27]。編碼一個定位于液泡膜上的低親和力NO3?轉(zhuǎn)運蛋白，其表達(dá)不受硝酸鹽的誘導(dǎo)，而受銨鹽的誘導(dǎo)，主要參與細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽、銨鹽利用的調(diào)節(jié)[28]。在高濃度NO3?條件下低親和力轉(zhuǎn)運體OsNPF8.9 (OsNRT1.1) 和OsNPF2.4 (OsNRT1.6)發(fā)揮吸收NO3?的功能[29,30]。在低濃度NO3?條件下，NRT2家族成員的高親和力轉(zhuǎn)運蛋白OsNRT2.1、OsNRT2.2及其伴侶蛋白OsNAR2.1 起主導(dǎo)作用[31,32]。OsNRT2家族成員OsNRT2.3具有OsNRT2.3a和OsNRT2.3b兩種不同的剪接形式。編碼一個由516個氨基酸殘基組成的膜定位蛋白，負(fù)責(zé)NO3?在韌皮部的長距離運輸；編碼一個由486個氨基酸殘基組成的膜定位蛋白，在莖韌皮部高表達(dá)，在根部低表達(dá)，是一個pH敏感的NO3?轉(zhuǎn)運蛋白，其發(fā)揮功能不需要OsNAR2.1的協(xié)助[33,34]。

2.2 NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運

在淹水環(huán)境中生長的植物主要以NH4+為氮源。NH4+的攝入主要由NH4+轉(zhuǎn)運體家族(ammonium transporter/methylammonium permease/rhesus, AMT/ MEP/Rh)來完成。在植物中，NH4+轉(zhuǎn)運體主要有AMT1和AMT2/MEP兩個蛋白亞家族。目前研究表明，AMT家族成員在擬南芥中有6個、衣藻()中有8個、水稻中有10個、楊樹(L.)中有14個[35,36]。

擬南芥的根系吸收NH4+主要由、、和四個基因負(fù)責(zé)，它們均編碼定位于細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運蛋白，并在根表皮細(xì)胞高表達(dá)，在氮源缺乏或供應(yīng)蔗糖的情況下，這4個基因的表達(dá)均上調(diào)[37,38]。這4個成員的NH4+吸收能力排序為：AtAMT1.1 = AtAMT1.3 > AtAMT1.2 > AtAMT1.5，其中AtAMT1.1、AtAMT1.2 和AtAMT1.3三個成員承擔(dān)了擬南芥根系對NH4+吸收量的90%[39,40]。

水稻主要以吸收NH4+為主。目前發(fā)現(xiàn)水稻中至少有10個OsAMT成員，分為OsAMT1、OsAMT2、OsAMT3和OsAMT4四個家族[41]。其中OsAMT1、OsAMT2、OsAMT3各包含3個成員，OsAMT4只有1個成員。OsAMT1家族成員屬于高親和力NH4+轉(zhuǎn)運體(high-affinity transport system, HATS)。在NH4+濃度較低時，高親和力的銨轉(zhuǎn)運體負(fù)責(zé)植物根系對NH4+的吸收，會表現(xiàn)飽和動力學(xué)特征；而當(dāng)NH4+濃度較高(1～40 mmol/L)時，低親和力NH4+轉(zhuǎn)運體起主導(dǎo)作用，不會表現(xiàn)出飽和動力學(xué)特征[42]。在水稻根部和地上部組成型表達(dá)，其表達(dá)水平受底物積累的反饋調(diào)節(jié)；在根部特異性表達(dá)，其表達(dá)水平受NH4+的誘導(dǎo)；同樣在根部特異性表達(dá)，其表達(dá)水平受高濃度銨的抑制。根部游離的谷氨酸鹽抑制的表達(dá)，但可以促進(jìn)和的表達(dá)[36]。

2.3 植物的氮素同化途徑

植物根系吸收的不同形式的氮源需要經(jīng)過一系列的同化作用才能被植物體利用。植物吸收的NO3?大部分被運送至地上部分進(jìn)行同化與利用。首先在細(xì)胞質(zhì)中，NO3?在硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)的作用下被還原成NO2?，隨后NO2?被運送至細(xì)胞質(zhì)體中，在亞硝酸還原酶(nitrite reductase, NiR)的作用下轉(zhuǎn)變成NH4+，最后NH4+在谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(glutamine synthetase/ferredoxin-glutamate syn-thase, GS/Fd-GOGAT)的作用下進(jìn)入谷氨酸循環(huán)。首先GS催化NH4+與谷氨酸結(jié)合生成谷氨酰胺，隨后谷氨酰胺與三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物2-酮戊二酸(2-OG)在GOGAT催化作用下生成兩個谷氨酸[43]。參與GS/GOGAT循環(huán)的酶主要是定位于葉綠體的GS2和Fd-GOGAT以及定位在細(xì)胞質(zhì)中的GS1和NADH-GOGAT (nicotinamide adenine dinucleotide- glutamate synthase)。

水稻GS1家族有3個成員。對水稻的生長和灌漿非常重要，幾乎在水稻的所有組織中都能檢測到的表達(dá)，在葉片中表達(dá)最高。在根部特異性表達(dá)，不僅參與NH4+在根部的同化過程，還參與水稻對高溫的響應(yīng)；的突變體其分蘗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重均顯著減少，總氨基酸、谷氨酸和天冬酰胺含量顯著下降，表明其在根部的NH4+同化過程中起著重要作用[44]。主要在小穗中表達(dá)，并且和均不能補償?shù)墓δ躘45]。主要在葉片的葉綠體中表達(dá)，在光呼吸作用釋放出來的NH4+的再同化過程中起主導(dǎo)作用[46]。

由于NH4+對植物具有毒害作用，因此植物根系從土壤吸收的NH4+大部分在根部進(jìn)行同化，然后主要以谷氨酸和谷氨酰胺的形式向地上部運輸，在水稻中OsGS1.2和OsNADH-GOGAT1在這個過程中起主要作用。當(dāng)外界NH4+濃度升高時，和在根部表皮細(xì)胞和外皮層細(xì)胞中的表達(dá)量會顯著上升，從而將NH4+快速同化，生成的谷氨酰胺和谷氨酸被運輸?shù)降厣喜縖47]。

3 植物的氮素代謝調(diào)控

氮代謝是植物生命活動中最基本的物質(zhì)代謝過程之一。植物在長期的進(jìn)化過程中，形成了一套復(fù)雜的、精細(xì)的氮素代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來感知、響應(yīng)氮素水平的動態(tài)變化以快速獲取生長所需的氮營養(yǎng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，植物的氮素代謝也受到多種轉(zhuǎn)錄因子、miRNA、植物激素等的共同調(diào)控。

3.1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物氮代謝

轉(zhuǎn)錄因子是一類能識別基因上游啟動子特異性基序，調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。研究表明，NAC (NAM, ATAF, CUC)、NLP (NIN-LIKE protein)、BTB (Bric-a-Brac/Tramtrack/Broad)、Dof (DNA-binding with one finger)、bZIP (basic leucine zipper)和MYB (v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)等轉(zhuǎn)錄因子均參與植物氮代謝的調(diào)控過程。NAC是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。水稻基因表達(dá)受低氮誘導(dǎo)，OsNAC42蛋白可與啟動子結(jié)合進(jìn)而激活的表達(dá)[27]。NLP是一類調(diào)控氮誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[48]，能夠調(diào)控、()、和()等NO3?響應(yīng)基因的表達(dá)。此外，Ca2+依賴蛋白激酶III亞族(subgroup III Ca2+- sensor protein kinases, CPKs) 中的成員CPK10/30/32能轉(zhuǎn)導(dǎo)NO3?信號誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ca2+濃度變化，通過磷酸化激活NLP蛋白的活性，組成NO3?-CPK-NLP信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而促進(jìn)根系和葉片發(fā)育[49]。擬南芥/編碼BTB家族蛋白，其表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子NLP調(diào)控。在低氮條件下，BT1/BT2通過負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)來影響氮吸收[50]。Dof是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。水稻中OsDOF18能調(diào)控下游多個基因和氮同化基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)NH4+的運輸和氮分配[51]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物氮信號傳導(dǎo)、氮代謝和碳–氮平衡過程中均發(fā)揮重要作用，如小麥TabZIP60負(fù)調(diào)控氮素利用[52]。水稻中的生長調(diào)控因子OsGRF4蛋白能夠直接激活氮吸收和同化相關(guān)基因的表達(dá)，同時也能激活光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，實現(xiàn)對植物碳–氮代謝平衡的調(diào)控[15]。MYB是一類包含Myb保守結(jié)構(gòu)域、具有調(diào)控植物生長發(fā)育功能的轉(zhuǎn)錄因子。水稻MYB61是一種調(diào)節(jié)纖維素合成的轉(zhuǎn)錄因子，其基因表達(dá)受低氮誘導(dǎo)并受OsGRF4的調(diào)控，因此OsGRF4-MYB61信號通路將纖維素合成與氮響應(yīng)代謝聯(lián)系在一起[53]。Varala等[54]將機(jī)器學(xué)習(xí)引入到基于時間序列的氮反應(yīng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，明確了氮信號相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的時序性調(diào)控關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)146個能夠響應(yīng)氮信號的新轉(zhuǎn)錄因子。Gaudinier等[55]利用大規(guī)模酵母單雜交(yeast one- hybrid, Y1H)篩選調(diào)節(jié)氮代謝的轉(zhuǎn)錄因子，并結(jié)合大數(shù)據(jù)分析得到了一個氮代謝相關(guān)的酵母單雜交網(wǎng)絡(luò)(yeast one-hybrid network for nitrogen-associated metabolism, YNM)，并通過計算預(yù)測了在氮代謝中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。這些研究為深入研究植物氮吸收、代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了很大的幫助。

3.2 MicroRNA調(diào)控植物氮代謝

MicroRNA (miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長度約為20～25 bp。miRNA對靶基因mRNA穩(wěn)定性及其翻譯過程的作用，是植物在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因功能的重要方式之一[56]。

第一個將miRNA與氮素利用聯(lián)系起來的基因是miRNA167靶標(biāo)基因()。研究發(fā)現(xiàn)，在根的中柱鞘中，硝酸鹽和谷氨酰胺/谷氨酸抑制的表達(dá)，從而增強的轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致側(cè)生根數(shù)目增多[57]。()的表達(dá)受硝酸鹽誘導(dǎo)，高表達(dá)能抑制主根生長而促進(jìn)側(cè)根生長，而氮的代謝物促進(jìn)的表達(dá)，隨后會抑制的表達(dá)[58]。和以及它們的下游基因形成了一個改變植物根系結(jié)構(gòu)來響應(yīng)氮信號的反饋機(jī)制。

在氮饑餓狀態(tài)下，(,)家族成員的表達(dá)量上升，這是由于的表達(dá)下降引起的。在低氮條件下，在韌皮部的表達(dá)量下降，暗示著能夠在植物體內(nèi)的氮含量信號從莖至根的長距離傳輸過程中發(fā)揮作用[59]。過表達(dá)會抑制氮誘發(fā)的側(cè)根生長，但能夠通過增強磷轉(zhuǎn)運基因的表達(dá)來提高作物的含磷量，這說明能夠聯(lián)系氮、磷信號通路[60]。磷饑餓能誘導(dǎo)的表達(dá)，進(jìn)而降低靶基因()的表達(dá)，而NLA參與植物低氮逆境脅迫響應(yīng)。在低氮條件下，與野生型相比，突變體中能積累更多的磷[61]。因此，miRNA不僅通過改變植物根系構(gòu)型和氮信號的長距離傳輸，還通過與磷信號通路互作來調(diào)節(jié)植物根系對氮的響應(yīng)。

3.2 植物激素信號與氮信號的互作

環(huán)境中的氮源還是植物生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境脅迫的重要信號物質(zhì)。許多氮代謝與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的最新發(fā)現(xiàn)都將氮信號與植物激素信號聯(lián)系在一起。

生長素(Indole-3-acetic acid, IAA)的極性運輸是由頂部運送至基部，促進(jìn)側(cè)根的起始和發(fā)育。因此，IAA一直被認(rèn)為是介導(dǎo)氮信號從地上部傳遞至地下部的媒介[62]。NRT1.1可以通過調(diào)節(jié)硝酸鹽依賴的生長素運輸和硝酸鹽信號途徑來調(diào)控側(cè)根的生長。模擬磷酸化的AtNPF6.3/AtNRT1.1T101D的突變表現(xiàn)出較強生長素運輸調(diào)節(jié)能力，促進(jìn)生長素快速橫向流動，而非磷酸化的AtNPF6.3/AtNRT1.1T101A的突變表現(xiàn)出較弱的生長素運輸調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致生長素在根尖積累，表明低NO3?誘導(dǎo)的T101磷酸化影響了生長素運輸從而調(diào)節(jié)生長素介導(dǎo)的側(cè)根生長[63]。NLP7能誘導(dǎo)生長素生物合成基因()和生長素外排基因()的表達(dá)[49]。在低氮條件下，突變體在側(cè)根原基中的生長素積累減少，側(cè)根的形成受到抑制[64]。Gaudinier等[55]構(gòu)建的酵母單雜交網(wǎng)絡(luò)表明生長素響應(yīng)因子ARF9能調(diào)控PNR (primary nitrate responses)基因(例如和())的表達(dá)；ARF18能調(diào)控下游氮代謝基因和的表達(dá)。在水稻中，()編碼一個負(fù)調(diào)控生長素合成的酶，其表達(dá)水平受外界氮供應(yīng)的調(diào)控從而改變植物體內(nèi)的生長素含量，進(jìn)而影響生長素響應(yīng)因子OsARF6和OsARF17對下游氮代謝相關(guān)基因的調(diào)控作用，最終影響植物的氮代謝[65]。

脫落酸(abscisic acid, ABA)被認(rèn)為是一種參與植物響應(yīng)脅迫的應(yīng)激激素。外界高濃度的氮素能夠抑制擬南芥?zhèn)雀l(fā)育，ABA信號途徑可能參與其中[66]。ABA不敏感突變體(、、)和ABA合成缺失突變體(、、和)的側(cè)根生長對高濃度NO3?的抑制作用不敏感。在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子ABI2的突變體中，NO3?誘導(dǎo)表達(dá)和側(cè)根生長的效應(yīng)減弱，說明ABI2在NO3?信號傳遞途徑中發(fā)揮作用[21]。赤霉素信號途徑的DELLA蛋白調(diào)控植物生長發(fā)育對氮肥的響應(yīng)。一方面，DELLA蛋白可以與OsGRF4互作，抑制OsGRF4-GIF1轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體的形成，從而抑制OsGRF4對下游氮代謝基因的激活作用，降低作物的氮吸收能力[15]；另一方面，DELLA蛋白結(jié)合GID1蛋白抑制氮響應(yīng)因子NGR5降解，而NGR5能促進(jìn)植物分蘗，調(diào)控植株在高氮水平下的分蘗響應(yīng)。氮響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子LBD可以直接結(jié)合在啟動子上調(diào)控的表達(dá)，而OsTCP19作為轉(zhuǎn)錄因子可以抑制油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids, BRs)信號途徑中的關(guān)鍵組分()的表達(dá)，從而調(diào)控水稻分蘗。LBD-OsTCP19-DLT通路證明了BR信號途徑直接參與氮調(diào)控植物生長發(fā)育的過程[67]。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)處理使水稻根系中和的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平均降低，并且根系中的NO3?和NH4+轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著下降，抑制了根中氮素的吸收和同化，并且MeJA 還會導(dǎo)致質(zhì)體分解和谷氨酸脫氫酶上調(diào)，促進(jìn)葉片中氮的再利用[68]。

4 提高作物氮肥利用效率

提高作物品種的氮肥利用效率，減少氮肥投入和環(huán)境污染已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中一個艱巨的挑戰(zhàn)。影響作物氮利用效率的主要因素包括兩個部分：氮吸收效率(nitrogen uptake efficiency, NUpE)和氮利用效率(nitrogen utilization efficiency, NUtE)。氮吸收效率是指成熟農(nóng)作物地上部分的含氮量與土壤中含氮量的比值；氮利用效率是指單株粒重與成熟農(nóng)作物地上部分的含氮量之比[69]。一般來說，在高氮條件下，氮吸收效率與氮效率的關(guān)聯(lián)較大，而在低氮條件下，氮利用效率與氮效率的關(guān)聯(lián)性較大[70]。

提高氮的吸收、同化效率是提高作物氮效率最有效的途徑。例如，高表達(dá)能夠增加作物產(chǎn)量并提高NUE，因此，將該基因表達(dá)水平較高的秈稻等位基因?qū)氲奖磉_(dá)水平較低的粳稻品種中，可以顯著改良作物的NUE[25]。秈稻類型基因編碼具有更強活性的硝酸還原酶NR2，將秈型等位基因?qū)氲骄酒贩N中能有效地提高分蘗數(shù)、產(chǎn)量和NUE[71]。野生稻來源的優(yōu)異等位基因OsNPF6.1能提高氮吸收和NUE，并在低氮條件下提高水稻的產(chǎn)量[27]。過表達(dá)和均可以提高水稻的產(chǎn)量和NUE[28,33]；使用的啟動子驅(qū)動基因在根和莖中特異性高表達(dá)可以顯著提高水稻的NUE和谷物產(chǎn)量[72]。過表達(dá)后能夠促進(jìn)側(cè)根的形成，提高水稻NUE和產(chǎn)量[73]。和過表達(dá)后能增加水稻的分蘗、提高NUE和產(chǎn)量[74,75]。通過增加亞硝酸還原酶基因啟動子中的硝酸鹽反應(yīng)順式元件(nitrate-responsive cis-element, NRE)可以顯著地增強其氮同化的功能[76]。使用擬南芥的啟動子驅(qū)動一個由和嵌合產(chǎn)生的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)可以激活植物體內(nèi)硝酸鹽的再利用，從而提高NUE和產(chǎn)量[77]。在水稻中過量表達(dá)能夠增強水稻根系對NH4+的吸收，在低濃度的NH4+環(huán)境下能促進(jìn)水稻生長，提高NUE和產(chǎn)量；但在高濃度的NH4+環(huán)境下植株會表現(xiàn)出銨中毒[78]。過量表達(dá)可以在高氮條件下協(xié)同提高水稻的NUE和產(chǎn)量[79]，但也有研究表明過量表達(dá)GS后會破壞碳–氮代謝平衡，從而影響水稻的生長和產(chǎn)量[44]。

NUE是一個復(fù)雜性狀，受植物生命周期中不同的代謝、發(fā)育和環(huán)境信號網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同控制。因此，僅僅通過提高植物的氮素吸收和同化來提高NUE存在著局限性，而通過優(yōu)化植物氮素響應(yīng)、代謝信號網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)性協(xié)調(diào)植物的生長發(fā)育和代謝過程來提高作物NUE是一個更加理想的策略。()基因編碼的植物G蛋白的γ亞基，其通過與水稻Gα亞基(RGA1)和Gβ亞基(RGB1)互作共同調(diào)控植物的氮響應(yīng)。顯性等位基因可使植物在營養(yǎng)生長期的地上部生長發(fā)育對氮不敏感，但能增強植物根系的氮吸收和同化能力，提高氮肥利用效率，進(jìn)而提高收獲指數(shù)和產(chǎn)量[80]。MYB61是聯(lián)系碳–氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點，受到OsGRF4的調(diào)控，其啟動子區(qū)域存在一個helitron轉(zhuǎn)座子插入的秈粳分化，將不含轉(zhuǎn)座子插入的、秈稻來源的導(dǎo)入到粳稻品種中可以同時提高作物的纖維素合成水平和NUE，并在低氮條件下促進(jìn)增產(chǎn)[53]。編碼一個葉綠體蛋白，其功能缺失突變可延遲植物衰老，在低氮條件下提高NUE，攜帶啟動子小片段插入的低表達(dá)的突變類型可在低氮條件下提高NUE和產(chǎn)量[81]。能夠響應(yīng)外界的氮信號，通過改變生長素的水平來調(diào)控氮代謝，啟動子存在520 bp的片段插入/缺失的秈粳差異，將片段缺失型低表達(dá)的秈稻等位基因?qū)氲骄局锌梢燥@著提高其NUE和產(chǎn)量[65]。啟動子在不同品種中存在29 bp的插入/缺失，缺失型的啟動子可以使氮響應(yīng)負(fù)調(diào)控因子LBD蛋白高效地結(jié)合在該位點并抑制的表達(dá)，從而促進(jìn)水稻的分蘗發(fā)育。而在我國現(xiàn)代水稻品種中這一氮高效的變異類型幾乎全部丟失，將該等位基因?qū)氍F(xiàn)代水稻品種中可以在少施氮肥的條件下顯著提高水稻的NUE[67]。DELLA蛋白是“綠色革命”的關(guān)鍵蛋白，其在作物中的高積累量賦予了“綠色革命”品種半矮化、抗倒伏、高產(chǎn)、低NUE等特性，其效應(yīng)與關(guān)鍵作用因子OsGRF4和NGR5密切相關(guān)。的優(yōu)異等位基因GRF4能顯著增加自身的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，使得DELLA-OsGRF4平衡向OsGRF4豐度增加傾斜，可在不增加作物株高的情況下協(xié)同提高作物的光合作用和氮肥利用效率[15]；能響應(yīng)土壤的氮素水平變化，正向調(diào)控水稻的生長發(fā)育，提高的表達(dá)能夠保持其半矮稈、耐倒伏、多分蘗等高產(chǎn)特性的同時，提升水稻的NUE；在“綠色革命”品種中聚合應(yīng)用和優(yōu)異等位基因可以進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量和NUE[16]。

5 結(jié)語與展望

氮肥是促進(jìn)作物生長發(fā)育和產(chǎn)量提高的重要因素。通過遺傳改良培育氮肥高效利用的農(nóng)作物新品種對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。利用各種種質(zhì)資源材料和遺傳材料，深入挖掘氮肥利用和吸收效率相關(guān)的關(guān)鍵基因、解析其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并將優(yōu)異等位基因用于育種，是培育氮高效品種的重要途徑。近年來，隨著功能基因組學(xué)的不斷發(fā)展，植物的氮吸收、代謝及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到了不斷的完善，越來越多具有改良作物NUE和提升產(chǎn)量潛力的基因被發(fā)現(xiàn)，但如何結(jié)合植物生長和代謝平衡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將這些優(yōu)良的基因應(yīng)用到育種實踐中，培育出“少投入、多產(chǎn)出、環(huán)境友好”的資源高效型作物品種還需要很大努力。

總之，隨著氮素吸收、代謝和響應(yīng)的信號傳導(dǎo)分子機(jī)制的不斷解析，必將極大地促進(jìn)農(nóng)作物NUE和產(chǎn)量的協(xié)同改良、推動新一輪的“綠色革命”。

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Genetic improvement of nitrogen use efficiency in crops

Shan Li1, Yunzhi Huang1, Xueying Liu2, Xiangdong Fu2,3

Nitrogen (N) is an essential mineral nutrient for plant growth and development. N deficiency is the major factor limiting plant growth and crop production in most natural and agricultural soils. The green revolution of the 1960’s boosted crop yields through cultivation of semi-dwarf plant varieties. However, green revolution wheat and rice varieties have relatively poor nitrogen use efficiency (NUE), require a high N fertilizer supply to achieve maximum yield potential, and this leads to an increase in production costs and environmental problem. Therefore, a major challenge for sustainable agriculture is whether improvement of NUE through the reduction of N fertilizer supply can be achieved without yield penalty. In this review, we summarize the recent advances in understanding of molecular mechanisms underlying the regulation of N-responsive plant growth, utilization and possibility for improvements of NUE in crops, and new breeding strategies through modulation of N-responsive growth-metabolism coordination for future sustainable agriculture.

rice; green revolution; nitrogen use efficiency; sustainable agriculture

李姍，2012—2018年就讀于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，在傅向東課題組攻讀博士學(xué)位，目前任南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院教授，研究方向：不同植物激素互作調(diào)控水稻氮肥利用效率的分子機(jī)制。博士期間，主要研究了赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控水稻氮肥高效利用的分子機(jī)制，揭示了半矮稈基因?qū)е伦魑锏世眯式档偷脑?，闡明了DELLA-OsGRF4模塊調(diào)控氮肥利用效率的分子機(jī)制，為提高“綠色革命”半矮稈品種氮肥利用效率提供了新策略。博士論文《提高水稻產(chǎn)量和氮肥利用效率的分子機(jī)制研究》獲得2020年中國科學(xué)院優(yōu)秀博士生論文。

2021-02-18;

2021-04-02

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31830082, 91935301)和江蘇省自然科學(xué)基金項目(編號：BK20200540)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31830082, 91935301) and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20200540)]

李姍，博士，教授，研究方向：植物激素調(diào)控水稻養(yǎng)分高效利用。E-mail: shanli@njau.edu.cn

黃允智，在讀博士研究生，研究方向：植物激素調(diào)控水稻養(yǎng)分高效利用。E-mail: 2020201051@stu.njau.edu.cn

李姍和黃允智并列第一作者。

傅向東，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)的激素調(diào)控機(jī)理。E-mail: xdfu@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.21-064

2021/4/26 15:01:23

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210425.1639.002.html

(責(zé)任編委: 儲成才)