蔣婧，趙安麒，謝甜，陳淑藯，李勁松

資源與平臺

全基因組蛋白質(zhì)的標(biāo)簽細胞和小鼠資源庫建設(shè)

蔣婧，趙安麒，謝甜，陳淑藯，李勁松

中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所), 基因組標(biāo)簽計劃研發(fā)中心，上海 200031

小鼠是最廣泛使用的模式生物，構(gòu)建基因改造的小鼠模型是研究基因功能和疾病發(fā)生機制的重要手段。從20世紀(jì)80年代發(fā)展至今，小鼠基因改造技術(shù)更新迭代，主要包括胚胎干細胞介導(dǎo)的同源重組策略、配子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因策略、以及最新基于CRISPR/Cas9技術(shù)的遺傳改造策略等。由我國科學(xué)家自主研發(fā)的全新小鼠基因改造技術(shù)——“人造精子細胞”(或“類精子干細胞”)介導(dǎo)的半克隆技術(shù)與以往策略相比，具有小鼠構(gòu)建周期短、效率高、成本低、應(yīng)用場景兼容性強等特點。為了擺脫我國小鼠實驗動物“卡脖子”風(fēng)險，填補標(biāo)簽蛋白質(zhì)小鼠資源庫的國際空白，中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心進行了戰(zhàn)略資源布局，于2017年啟動了基因組標(biāo)簽計劃(genome tagging project, GTP)，并成立了GTP研發(fā)中心致力于建立全新的標(biāo)簽細胞和小鼠戰(zhàn)略資源庫。GTP研發(fā)中心通過對“人造精子細胞”基因組上編碼蛋白質(zhì)的基因原位系統(tǒng)性地添加標(biāo)簽序列，建立了可用液氮保存的標(biāo)簽細胞資源庫，并作為生產(chǎn)標(biāo)簽小鼠的種子貯備。當(dāng)需要標(biāo)簽小鼠時，利用半克隆技術(shù)將標(biāo)簽細胞注射到小鼠卵子中，一步法獲得標(biāo)簽小鼠。標(biāo)簽小鼠可通過標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)簽抗體監(jiān)測特定蛋白質(zhì)從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的在體、實時、動態(tài)研究。目前，GTP研發(fā)中心已構(gòu)建1532個標(biāo)簽細胞和277個標(biāo)簽小鼠，初步形成了具有特色標(biāo)簽產(chǎn)品戰(zhàn)略資源庫；已有242個標(biāo)簽小鼠品系被分發(fā)到3個囯家15個地區(qū)的32個研究機構(gòu)，供66個研究團隊使用。同時，GTP研發(fā)中心已建立完備的標(biāo)簽產(chǎn)品信息，定期在GTP官網(wǎng)上發(fā)布更新，供科研人員查詢、訂購和定制。后續(xù)標(biāo)簽小鼠的配繁規(guī)律、標(biāo)簽蛋白質(zhì)組織圖譜描繪、發(fā)表文獻等也會陸續(xù)更新到GTP官網(wǎng)。GTP研發(fā)中心將對標(biāo)行業(yè)尖端，打造全球獨特性戰(zhàn)略資源，為蛋白質(zhì)功能研究提供標(biāo)準(zhǔn)化平臺，推動生命科學(xué)的發(fā)展和臨床轉(zhuǎn)化。

基因組標(biāo)簽計劃；“人造精子細胞”；半克隆技術(shù)；標(biāo)簽小鼠；戰(zhàn)略資源

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，為揭示生命現(xiàn)象的普遍規(guī)律，科學(xué)家們往往需要借助模式生物來進行研究驗證。其中，小鼠()是最佳且使用范圍最廣泛的模式動物。作為哺乳動物的代表，小鼠體型小、易飼養(yǎng)、世代周期短、繁殖力強、性成熟早、遺傳操作簡便、實驗方便快捷，并且小鼠基因組計劃已測序完成，基因組序列清晰，99%的人類蛋白質(zhì)編碼基因都有小鼠同源基因[1]。小鼠生理生化情況和發(fā)育進程也與人類相似，是研究人類基因功能、模擬人類疾病發(fā)病過程及對藥物反應(yīng)的優(yōu)秀動物模型[2]。目前小鼠已在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)中被大量使用。利用PubMed數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在2000～2020年間，全球利用小鼠模型發(fā)表相關(guān)研究論文共484,076篇，呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(圖1)。

圖1 統(tǒng)計2000～2020年以小鼠模型為研究材料發(fā)表的科研論文

小鼠成為最佳模式動物還受益于小鼠基因改造技術(shù)的成熟。20世紀(jì)七八十年代，利用顯微操作技術(shù)進行的基因改造技術(shù)誕生[3～5]。1982年，第一個人工設(shè)計的表達大鼠生長激素基因的MGH (metallo-thionein-growth hormone)小鼠誕生，標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動物的開端[6]。隨后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷地發(fā)展和成熟，形成了多種小鼠基因改造策略，主要包括胚胎干細胞介導(dǎo)的同源重組策略、配子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因策略等。由于早期改造策略構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)入的外源基因在基因組中隨機整合，導(dǎo)致整合位點和插入拷貝數(shù)不確定等問題，需要不斷對后代進行交配篩選才能獲得蛋白表達穩(wěn)定的小鼠。美國杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory，簡稱JAX)通過收錄全美各家實驗室蛋白表達穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠而發(fā)展成為全球最大的基因修飾小鼠品系供應(yīng)商，我國科研工作者不得不花費大量經(jīng)費從國外引進別人已報道的工具小鼠品系。近年來隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，尤其是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)明，加速了整個基因改造領(lǐng)域的發(fā)展，小鼠資源庫的全球格局也發(fā)生變化，呈現(xiàn)出小鼠模型標(biāo)準(zhǔn)化、精準(zhǔn)化，供應(yīng)規(guī)?；奶攸c。

在這關(guān)鍵發(fā)展時期，一種由我國科學(xué)家獨立自主研發(fā)的全新小鼠基因改造技術(shù)——“人造精子細胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)孕育而生，并入選為2012年“中國科學(xué)十大進展”[7,8]。為了擺脫我國小鼠實驗動物“卡脖子”風(fēng)險，中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(Center for Excellence in Molecular Cell Science, CEMCS，原生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所)進行了戰(zhàn)略資源布局，于2017年啟動了基因組標(biāo)簽計劃(genome tagging project, GTP)，成立了GTP研發(fā)中心來建立全新的標(biāo)簽細胞和小鼠戰(zhàn)略資源庫[9]。本文將對GTP研發(fā)中心標(biāo)簽產(chǎn)品資源庫的技術(shù)優(yōu)勢、建設(shè)理念、建設(shè)情況以及對外服務(wù)等工作內(nèi)容進行簡要介紹，以增強研究者和公眾的了解。

1 小鼠基因改造主流技術(shù)

早期受技術(shù)限制，基因敲入(knockin, KI)大多采用制備轉(zhuǎn)基因技術(shù)小鼠來實現(xiàn)。但是由于轉(zhuǎn)入的基因是隨機整合的，導(dǎo)致產(chǎn)生整合位點和插入拷貝數(shù)不確定等問題，因此需要不斷對后代進行交配篩選才能獲得蛋白表達穩(wěn)定的小鼠。另外隨著交配傳代，由于插入拷貝數(shù)稀釋以及插入位點容易導(dǎo)致周圍基因沉默等原因，首建鼠的表型容易在傳代過程中丟失，給后期建系和重復(fù)實驗帶來諸多困難。并且，同一基因片段在不同位點插入的轉(zhuǎn)基因小鼠品系可能會出現(xiàn)表型不一致的情況[2]。綜上所述，篩選到具有穩(wěn)定表型的轉(zhuǎn)基因小鼠耗費時間長、效率低，嚴(yán)重影響獲得易用工具小鼠的效率，這也是造成早期國內(nèi)科研工作者需要花費大量經(jīng)費從國外引進已報道的工具小鼠品系的主要原因。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立于2012年，通過sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶對基因組進行剪切和編輯，從而能夠在細胞和受精卵中直接進行高效的基因修飾，大幅提高了基因編輯效率，降低了基因編輯成本[10～12]。其簡便性使得科研工作者可以根據(jù)自身科學(xué)研究需求來定制各種基因改造小鼠模型。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基因組上的精準(zhǔn)定位和高效改造，促使小鼠基因改造領(lǐng)域升級，呈現(xiàn)出小鼠模型標(biāo)準(zhǔn)化和精準(zhǔn)化的特點。目前小鼠基因改造行業(yè)普遍使用的主流技術(shù)都借力于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，根據(jù)產(chǎn)生小鼠的方式不同，分為受精卵注射法和胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES細胞)介導(dǎo)法。其中受精卵注射法由于其簡便性，市場占比更高。

受精卵注射法是將sgRNA、Cas9核酸酶和同源重組片段利用顯微注射技術(shù)直接注入小鼠受精卵中，從而獲得陽性基因改造F0代小鼠[13]。由于CRISPR/ Cas9在小鼠受精卵發(fā)育過程中都可能進行基因編輯，經(jīng)常會產(chǎn)生基因型嵌合的個體。因此該方法獲得的F0代雄鼠需要與野生型雌鼠進行交配，從而篩選鑒定到穩(wěn)定遺傳的陽性F1小鼠。該方法主要用于基因敲除(knockout, KO)和點突變等基因修飾，基因改造效率高，生產(chǎn)周期短。該方法在獲得F0小鼠后才能鑒定小鼠的基因型，并且由于CRISPR/Cas9切割隨機修復(fù)后的序列會有所不同，因此篩選出序列確定的純合子KO小鼠還需要花費較多工作量。另外由于注射大片段DNA的胚胎毒性高、同源重組效率低等特點，因此在插入片段大、同源重組效率低的KI基因改造上基本不采用該方法，而主要采用ES細胞介導(dǎo)法來進行。

ES細胞介導(dǎo)法建立于20世紀(jì)80年代[14～18]?，F(xiàn)行的技術(shù)路徑是先將sgRNA、Cas9核酸酶和同源重組質(zhì)粒導(dǎo)入到小鼠ES細胞中，在細胞水平上進行同源重組，體外篩選陽性基因改造ES細胞。再將陽性ES細胞通過顯微注射技術(shù)注入小鼠囊胚中，利用ES細胞的多能性獲得嵌合體小鼠，最后通過交配繁殖傳遞給下一代，獲得陽性基因改造小鼠。其中，僅有當(dāng)ES細胞嵌合入生殖細胞，才能獲得陽性小鼠。因此嵌合體的形成和生殖細胞傳遞是該方法的限速步驟。通常選用雄性ES細胞獲得較高嵌合率(70%以上)的嵌合體雄鼠，與野生型雌鼠進行交配，從而在大量子代中鑒定篩選到陽性小鼠。該方法順利的話也需要花費8個月到1年左右時間才能構(gòu)建一個基因改造小鼠。該方法除了需要熟練掌握顯微操作技術(shù)外，對ES細胞培養(yǎng)和打靶的要求也很高，所以目前只在插入片段大、同源重組效率低的KI基因修飾改造才使用。

2 GTP研發(fā)中心的技術(shù)優(yōu)勢

GTP研發(fā)中心采用的技術(shù)是我國科學(xué)家自主知識產(chǎn)權(quán)的“人造精子細胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)?！叭嗽炀蛹毎保址Q為孤雄單倍體胚胎干細胞(an-drogenetic haploid ESCs, AG-haESCs)或“類精子干細胞”，是從孤雄單倍體囊胚中建立的攜帶精子遺傳物質(zhì)的單倍體胚胎干細胞。將其注入到成熟的卵母細胞中, 能像精子一樣支持重構(gòu)胚胎的發(fā)育, 并產(chǎn)生健康的小鼠。孤雄單倍體胚胎干細胞注射入卵子的技術(shù)(intracytoplasmic AG-haESC injection, ICAHCI)被稱為半克隆技術(shù)(semi-cloning technology)[7,8]。進而將半克隆技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas9的基因編輯能力，能高效獲得基因改造小鼠[8]。

與ES細胞介導(dǎo)法相比，“人造精子細胞”同樣是一種ES細胞，可在體外進行基因改造；并且其單倍體屬性使得打靶效率比二倍體的ES細胞更高，能更好實現(xiàn)多個位點在同一套染色體上的改造。其次，“人造精子細胞”又具有精子的屬性，可通過ICAHCI注射一步法獲得基因改造小鼠，F(xiàn)0小鼠基因型全是陽性小鼠。由于“人造精子細胞”僅攜帶X染色體，無法攜帶Y染色體，所以該技術(shù)獲得的F0全是陽性雜合雌鼠，并且無法對Y染色體進行基因編輯。但是因為半克隆技術(shù)小鼠出生率很高(～20%)，一次ICAHCI注射即能獲得較多F0雌鼠，所以這個缺陷能夠通過超排4周齡F0雌鼠，并與野生型雄鼠進行IVF體外受精來彌補，從而比常規(guī)8周齡雄鼠交配能更快速獲得雜合F1雄鼠和雌鼠。因此“人造精子細胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)既擁有ES細胞介導(dǎo)法的體外編輯優(yōu)勢，又彌補了嵌合體小鼠的缺陷，能快速獲得基因型確定的F1雄鼠和雌鼠。“人造精子細胞”同ES細胞相似培養(yǎng)要求高，并且還需要維持單倍體，技術(shù)瓶頸高，不易掌握和推廣，需要通過建立專業(yè)化的技術(shù)服務(wù)平臺來發(fā)揮其優(yōu)勢(表1)。

與受精卵注射法相比，首先“人造精子細胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)的陽性篩選步驟是在細胞水平，而不是小鼠水平。該步驟陽性篩選的成本就降低了許多。其次“人造精子細胞”作為中間媒介形成的資源庫能像ES細胞庫一樣，體外進行大規(guī)模制備，而不受限于顯微注射儀、小鼠籠位等資源限制，并且儲存成本也低。再次，受精卵注射法構(gòu)建的F0小鼠為基因型嵌合小鼠，需要交配才能獲得基因型確定的F1小鼠。并且基因敲除的F0小鼠由于DNA的隨機修復(fù)，每只小鼠的基因型序列不一致，也為后續(xù)鑒定和交配帶來了許多麻煩。相比之下，半克隆技術(shù)獲得的F0小鼠基因型確定，陽性率為100%；并利用快速擴繁的方式獲得陽性F1小鼠，陽性率為50%，時間至少縮短1個月。最后，受精卵注射法在插入片段大、同源重組效率低的KI基因修飾改造上基本不采用，應(yīng)用場景受限。而“人造精子細胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)則無此限制，反而由于單倍體屬性，高難度的多個位點改造更具優(yōu)勢(表1)。

表1 3種基因改造小鼠方法的比較

綜上所述，“人造精子細胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)相比主流的兩種技術(shù)具有構(gòu)建基因改造小鼠周期短、效率高、成本低、應(yīng)用場景兼容性強等特點。并且“人造精子細胞”更利于全基因組大規(guī)模的改造和篩選，形成中間媒介的“人造精子細胞”資源庫，作為種子戰(zhàn)略資源生產(chǎn)和貯存的成本也低。當(dāng)需要活體小鼠時再進行ICAHCI注射獲得，可高效利用有限資源，節(jié)約科研經(jīng)費。但該技術(shù)的技術(shù)瓶頸高，需要通過建立專業(yè)化的技術(shù)服務(wù)平臺發(fā)揮競爭優(yōu)勢。

3 國內(nèi)外主要小鼠資源庫

JAX成立于1929年，是全球最大的基因修飾大小鼠品系供應(yīng)商，主要收集全美各實驗室小鼠品系，早期各種各樣基因組隨機插入的轉(zhuǎn)基因小鼠多收錄其中，因此小鼠品系繁多。截止2021年4月，JAX 在國際小鼠品系資源庫(International Mouse Strain Resource，IMSR，http://www.findmice.org/repository)數(shù)據(jù)顯示有11,465個小鼠品系(排第3，圖2)，其中有超600種Cre重組酶表達品系和近300種報告小鼠，并自主研發(fā)了22種高度免疫缺陷的人源化小鼠模型。JAX最大的亮點是嚴(yán)格質(zhì)控保證小鼠質(zhì)量，不計成本的細化所有品系的鑒定和繁殖工作，數(shù)據(jù)全球共享。因此經(jīng)過90多年的扎實積累，使得JAX小鼠成為實驗動物模型的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，定量標(biāo)識數(shù)據(jù)表征最完整，并被廣泛使用。JAX不僅向全球提供小鼠資源，還致力于維護兩大權(quán)威數(shù)據(jù)庫：小鼠基因組信息學(xué)(Mouse Genome Informatics)和小鼠表型組數(shù)據(jù)庫(Mouse Phenome Database)，二者都被科研工作者廣泛使用。

圖2 各機構(gòu)在IMSR上傳小鼠資源的數(shù)目和占比

IMSR上擁有的小鼠品系最多的是美國突變小鼠區(qū)域資源中心(Mutant Mouse Regional Resource Centers, MMRRC)，共有17,392個，其ES細胞數(shù)排第二，為42,614個。ES細胞數(shù)排第一的是美國德州農(nóng)工大學(xué)基因組醫(yī)學(xué)研究所，共142,543個。這表明這兩家機構(gòu)主要依靠傳統(tǒng)方法在ES細胞上進行隨機或目的突變來獲得突變小鼠，因此有較高的ES細胞資源儲量。另外，德國的歐洲突變小鼠存儲庫(European Mouse Mutant Archive, EMMA)有7119個小鼠品系(排第4，圖2)。日本理化所生物資源中心(RIKEN BioResource Research Center, RBRC)有5505個小鼠品系(排第5，圖2)。美國Taconic公司主要為歐洲和北美的制藥和生物醫(yī)學(xué)公司提供嚙齒類實驗動物模型及相關(guān)產(chǎn)品和服務(wù)，有2725個小鼠品系(排第7，圖2)。美國Charles River Laboratories是全球知名的CRO公司和動物模型服務(wù)提供商，有56個小鼠品系(排第20，圖2)。

國內(nèi)主要有江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，成立于2017年，脫胎于國家遺傳工程小鼠資源庫，在IMSR數(shù)據(jù)顯示有14,259個小鼠品系(排第2，圖2)。該公司主打小鼠全基因組的條件性敲除CKO/KO模型制作，即“斑點鼠”計劃，后還推出“免疫檢查點人源化計劃”及“人源腫瘤免疫資源庫”，目標(biāo)是發(fā)展成為全球最大的模式大小鼠資源供應(yīng)商。利用CRISPR/Cas9受精卵注射法的簡便性，集萃藥康公司快速擴增小鼠全基因組的CKO/KO資源庫，使其小鼠資源品系已趕超JAX。另外國內(nèi)規(guī)模較大的還有上海南方模式生物科技股份有限公司，以用戶定制服務(wù)為主，有5481個小鼠品系(排第6，圖2)。

4 GTP研發(fā)中心的發(fā)展歷程

在2017年5月的CEMCS頭腦風(fēng)暴會議上，基因組標(biāo)簽計劃(GTP)被第一次提出，引起了與會專家的共鳴。蛋白質(zhì)研究作為繼人類基因組計劃后廣受關(guān)注的重要科學(xué)問題，功能研究進展緩慢，接近50%的蛋白質(zhì)從未被研究，同時大量已知蛋白質(zhì)缺乏揭示其功能的研究手段。如果能將全基因組蛋白質(zhì)在模式動物體內(nèi)帶上容易識別的標(biāo)簽，就能使得追蹤和研究蛋白質(zhì)功能如同使用手機GPS在茫茫人海中進行對象識別和追蹤一般簡便、精準(zhǔn)、高效[9]。GTP設(shè)想提出后，CEMCS就一直大力推動GTP的實施和發(fā)展，通過召開多場學(xué)術(shù)研討會來探討其可行性與重要性，并通過中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(B類)“細胞命運可塑性的分子基礎(chǔ)與調(diào)控”(項目編號：XDB19010204)首席調(diào)控費撥付200萬元用于支持開展50個蛋白質(zhì)編碼基因標(biāo)簽的嘗試。上海市科學(xué)技術(shù)委員會對GTP高度重視，在聽取相關(guān)介紹后，于2017年給予了第一期的資助。在此背景下，CEMCS于2017年11月專門成立GTP研發(fā)中心來實施GTP項目和生產(chǎn)GTP標(biāo)簽產(chǎn)品。由于GTP項目的迅速推進，于2019年再次獲得上海市科委的資助。上海市I期項目《基于“人造精子”技術(shù)的重要基因標(biāo)簽研究》(項目編號：17411954900；執(zhí)行期：2017.12～2019.6，2000萬)的順利完成證明大規(guī)模開展蛋白質(zhì)標(biāo)簽的可行性；II期項目《基于基因組標(biāo)簽計劃的蛋白質(zhì)圖譜研究》(項目編號：19411951800；執(zhí)行期：2019.12～2020.11，1000萬)的順利完成表明GTP中試調(diào)試成功，標(biāo)志著GTP在產(chǎn)業(yè)化方面又向前邁進了一大步。2019年5月23日，CEMCS在上海舉辦以“基因組標(biāo)簽計劃(GTP)”為專題的香山科學(xué)會議(第S47次學(xué)術(shù)研討會)，共31家單位的50多位專家學(xué)者出席，會議圍繞“GTP與基礎(chǔ)生物學(xué)”和“GTP與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”兩個中心議題，進行了廣泛而深入的討論，就GTP實施的可行性、重要性以及潛在的應(yīng)用前景達成了共識。

GTP研發(fā)中心利用“人造精子細胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)來系統(tǒng)性在基因組上給編碼蛋白質(zhì)加上標(biāo)簽，建立液氮保存的標(biāo)簽細胞資源庫。用戶需要標(biāo)簽小鼠時，再復(fù)蘇標(biāo)簽細胞，ICAHCI注射到卵子中一步法獲得標(biāo)簽小鼠，從而建立標(biāo)簽小鼠資源庫[9]。2018年5月GTP研發(fā)中心正式運營，建立了165 m2的獨立實驗室，用于標(biāo)簽細胞的生產(chǎn)和質(zhì)量控制檢測，已配備了齊全的儀器設(shè)備，如流式細胞分選儀、生物安全柜、熒光顯微鏡、PCR儀、DNA/蛋白電泳儀、DNA/蛋白成像儀等；建立了實驗動物基地，用于標(biāo)簽小鼠的生產(chǎn)，共有3000個小鼠籠位，11間獨立飼育室、1間胚胎移植室、1間顯微注射室和4套顯微操作注射儀。GTP研發(fā)中心已培養(yǎng)一批核心技術(shù)骨干15人，建立起成熟的技術(shù)方案、完善的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)操作流程和信息化管理體系，確保GTP生產(chǎn)流程和產(chǎn)品質(zhì)量可控。在3年逐步發(fā)展的過程中，這支短小精悍的隊伍建立起1532個標(biāo)簽細胞資源庫和277個標(biāo)簽小鼠資源庫。

5 GTP標(biāo)簽產(chǎn)品戰(zhàn)略資源庫的建設(shè)

為了資源信息透明化，資源共享國際化，GTP研發(fā)中心建立了標(biāo)簽產(chǎn)品共享平臺，為全球科研工作者提供有力的信息支撐，方便用戶在線查詢和訂購。網(wǎng)址為http://www.sibcb.ac.cn/gtp/。官網(wǎng)上發(fā)布GTP研發(fā)中心已構(gòu)建完畢的標(biāo)簽細胞和標(biāo)簽小鼠的資源庫信息，詳盡記錄了每個標(biāo)簽細胞的標(biāo)簽插入位置、序列和標(biāo)簽蛋白質(zhì)的表達情況，以及每個標(biāo)簽小鼠的基因型鑒定、發(fā)表文獻等信息，方便研究者更好地了解和選擇。

5.1 GTP標(biāo)簽細胞資源庫

在GTP官網(wǎng)的標(biāo)簽細胞資源庫模塊下，點擊單個標(biāo)簽細胞可以看到如下信息：(1)目的基因：統(tǒng)一為打靶構(gòu)建時的NCBI基因名，隨著后續(xù)NCBI數(shù)據(jù)庫的更新，也會更換為最新基因名；(2) GTP編號：每種標(biāo)簽細胞生成唯一的GTP編號；(3)標(biāo)簽插入位點：通常為C端或N端，部分N端插入在信號肽后面，具體信息詳見打靶質(zhì)粒序列；(4)插入標(biāo)簽的類別：主要為HA標(biāo)簽，其他還有EGFP、mCherry、Flag等；(5)NCBI基因序列：統(tǒng)一為打靶構(gòu)建時參考的NCBI mRNA序列，用以區(qū)分同一蛋白質(zhì)的不同isoform形式；隨著NCBI數(shù)據(jù)庫的更新isoform信息可能會變化，但這一項信息仍然保持不變，用以定位該標(biāo)簽細胞的具體標(biāo)簽插入位點；(6)標(biāo)簽序列：可供下載插入的標(biāo)簽DNA序列；(7)同源重組質(zhì)粒序列：可供下載標(biāo)簽細胞打靶所用同源重組質(zhì)粒的序列，指示該標(biāo)簽細胞攜帶標(biāo)簽的位置和具體序列；(8) sgRNA序列：標(biāo)簽細胞打靶所選用的sgRNA序列；(9)標(biāo)簽細胞的Western blot (WB)結(jié)果：利用標(biāo)簽對應(yīng)的抗體進行WB，顯示在“人造精子細胞”中被標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達情況，可直觀分辨蛋白質(zhì)分子量大小和表達強弱；值得注意的是如果被標(biāo)記蛋白質(zhì)本身不在“人造精子細胞”中表達，則無法被檢測到；(10)標(biāo)簽細胞中被標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達強弱：由于所有標(biāo)簽細胞都用少數(shù)幾個對應(yīng)的標(biāo)簽抗體來檢測，所以可根據(jù)WB結(jié)果的曝光時長并對比抗體雜帶的強弱程度來半定量蛋白質(zhì)表達強度，共分為4種類別，定義為+++、++、+和–。

目前GTP標(biāo)簽細胞資源庫的產(chǎn)品主要分為兩大類：一類是根據(jù)客戶需求提交訂單來定制；二類是優(yōu)先聚焦轉(zhuǎn)錄因子和重要信號通路因子等基因來進行標(biāo)記，用于前沿科學(xué)研究。標(biāo)簽細胞由細胞生產(chǎn)技術(shù)員打靶完成后，會經(jīng)過多輪質(zhì)控確認無誤后再發(fā)布到GTP官網(wǎng)。所有標(biāo)簽細胞經(jīng)過跨同源臂PCR測序，排除轉(zhuǎn)基因并核對DNA序列正確；標(biāo)簽細胞經(jīng)過支原體檢測為陰性；細胞水平蛋白質(zhì)表達WB質(zhì)控檢測，評估蛋白質(zhì)表達強度；細胞生產(chǎn)技術(shù)員將所有信息上傳至GTP內(nèi)網(wǎng)，并進行質(zhì)粒和細胞入庫；細胞主管審核所有細胞數(shù)據(jù)；最后由信息管理部統(tǒng)一進行信息審查，審查無誤后再對外發(fā)布到GTP官網(wǎng)。

綜上所述，GTP標(biāo)簽細胞資源庫為自主研發(fā)建立，數(shù)據(jù)信息全，專業(yè)度高，數(shù)據(jù)更新快，產(chǎn)品質(zhì)量高，并具有獨特性、技術(shù)瓶頸高、不易被復(fù)制的特點，致力于發(fā)展成為我國標(biāo)簽細胞種子戰(zhàn)略資源。

5.2 GTP標(biāo)簽小鼠資源庫

為了充分利用“人造精子細胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)的優(yōu)勢，不浪費科研經(jīng)費，僅有實際研究需求提交的訂單才會安排標(biāo)簽小鼠的生產(chǎn)。標(biāo)簽小鼠生產(chǎn)與官網(wǎng)信息發(fā)布的流程為：復(fù)蘇庫存里液氮保存的標(biāo)簽細胞，進行ICAHCI注射，獲得F0標(biāo)簽雌鼠；優(yōu)化小鼠基因型鑒定引物，再次復(fù)核F0雌鼠基因型并測序驗證；超排4周齡F0雌鼠與野生型雄鼠進行IVF體外受精，快速獲得陽性雜合F1標(biāo)簽雄鼠和雌鼠；安排標(biāo)簽小鼠出庫，并發(fā)送客戶該標(biāo)簽小鼠名片；小鼠主管審核所有小鼠數(shù)據(jù)，確認無誤后將信息上傳至GTP內(nèi)網(wǎng)；最后由信息管理部再次進行信息審查，審查無誤后再發(fā)布到GTP官網(wǎng)。在GTP官網(wǎng)的標(biāo)簽小鼠資源庫模塊下，點擊單個標(biāo)簽小鼠可以看到如下信息：標(biāo)簽細胞信息(1)～(10)；(11)標(biāo)簽小鼠基因型鑒定信息和膠圖：通常用兩對PCR引物來區(qū)分純合子、雜合子和野生型小鼠；(12)參考文獻：記錄使用該標(biāo)簽小鼠進行相關(guān)研究發(fā)表的研究論文，供用戶參考。

除了以上嚴(yán)格生產(chǎn)流程外，GTP研發(fā)中心對標(biāo)簽小鼠資源庫做了詳盡的配套服務(wù)。首先，對所有標(biāo)簽小鼠都制作了名片，實現(xiàn)小鼠基因型鑒定的PCR條件全優(yōu)化和PCR試劑全國產(chǎn)化。每張標(biāo)簽小鼠名片包含有：標(biāo)簽小鼠名稱，GTP編號，基因型鑒定引物序列，測序引物序列，PCR反應(yīng)體系和程序，PCR結(jié)果膠圖與說明，并特殊標(biāo)記X染色體上的基因。需要特別注意的是，當(dāng)打靶基因位于X染色體時，其雄鼠鑒定結(jié)果僅能是純合子或野生型。其次，GTP研發(fā)中心在標(biāo)簽小鼠資源庫建立的過程中，不是一味地求多求快，而是每步穩(wěn)扎穩(wěn)打，對每個標(biāo)簽小鼠品系進行質(zhì)量控制，掌握每個品系標(biāo)簽小鼠的繁殖規(guī)律。盡管雜合子標(biāo)簽小鼠已能滿足實驗需求，可通過檢測標(biāo)簽蛋白質(zhì)來反映內(nèi)源目的蛋白質(zhì)的時空表達、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)等。但基于GTP的科學(xué)性，需要進一步明確標(biāo)簽蛋白質(zhì)的插入是否會對小鼠機體造成影響，因此GTP研發(fā)中心將每個品系標(biāo)簽小鼠的繁殖規(guī)律一直記錄到是否能由純合子繁殖籠產(chǎn)生全純合后代才終止。由于雜合小鼠繁殖籠交配獲得純合子的概率為25%，因此每個品系的純合配繁都需要花費幾個月的時間。經(jīng)過細化和統(tǒng)計繁殖情況，在277個標(biāo)簽小鼠品系中，已成功配繁至全純合終點的有134個品系，表明這134個內(nèi)源蛋白質(zhì)攜帶標(biāo)簽蛋白質(zhì)后對其本身功能并不會產(chǎn)生影響，更加堅定了GTP的科學(xué)性。此項工作會持續(xù)進行，后續(xù)每個標(biāo)簽小鼠品系的繁殖規(guī)律也會細化更新到GTP官網(wǎng)上。

綜上所述，GTP標(biāo)簽小鼠資源庫同樣為自主研發(fā)建立，數(shù)據(jù)信息全，專業(yè)度高，數(shù)據(jù)更新快，產(chǎn)品質(zhì)量高，并具有獨特性、技術(shù)瓶頸高、不易被復(fù)制的特點，致力于發(fā)展成為我國標(biāo)簽小鼠種子戰(zhàn)略資源。

5.3 GTP標(biāo)簽蛋白質(zhì)組織圖譜數(shù)據(jù)庫

基因組標(biāo)簽計劃(GTP)，不僅希望利用“人造精子細胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)為全基因組蛋白質(zhì)打上相同標(biāo)簽，獲得首創(chuàng)的標(biāo)簽細胞和標(biāo)簽小鼠戰(zhàn)略資源庫。還希望利用該戰(zhàn)略資源做出0到1的科學(xué)研究突破，僅用一個標(biāo)簽抗體即可識別所有的蛋白質(zhì)，開展基于標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)在體、實時、動態(tài)研究，促進生命活動規(guī)律及疾病發(fā)生發(fā)展機制的揭示，實現(xiàn)蛋白質(zhì)研究的標(biāo)準(zhǔn)化。要實現(xiàn)這一過程，不僅依托于廣大科研工作者使用GTP標(biāo)簽小鼠做出前沿科學(xué)研究，還要求GTP研發(fā)中心在這兩大戰(zhàn)略資源庫上做出特色蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，而不只是個生產(chǎn)基地。隨著標(biāo)簽戰(zhàn)略資源庫的逐步發(fā)展擴大，GTP研發(fā)中心一步步深入挖掘蛋白質(zhì)信息。GTP標(biāo)簽細胞的蛋白質(zhì)表達WB質(zhì)控檢測已經(jīng)給我們第一層蛋白質(zhì)信息，標(biāo)簽小鼠的組織圖譜描繪能給我們第二層信息。

GTP研發(fā)中心利用標(biāo)簽抗體來系統(tǒng)性平行性描繪GTP標(biāo)簽蛋白質(zhì)組織圖譜。從標(biāo)簽小鼠上分離腦、肝、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、肺、腸、胸腺、白色脂肪和睪丸11個器官組織，利用HA或其他標(biāo)簽抗體進行WB分析，共檢測了227個標(biāo)簽小鼠品系，其中組織WB陽性為160個品系，陽性率70.48%。組織分布率見圖3，睪丸和胸腺陽性比例最高，分別為82.5%和78.1%。由于目前GTP生產(chǎn)的標(biāo)簽小鼠主要為各個科學(xué)家研究迫切所需，具有偏好性，不具有廣譜代表性，因此該數(shù)據(jù)僅供參考。組織WB檢測陰性的標(biāo)簽小鼠，也不代表標(biāo)記失敗。部分由于蛋白質(zhì)自身表達的時空特異性，不在我們檢測的這11個成體器官組織中表達，又或者表達細胞類別少、表達豐度低等原因，需要根據(jù)每個蛋白質(zhì)的屬性在不同時期的器官組織中進一步分析。因此現(xiàn)階段的組織WB陽性率僅是一個基本參考指標(biāo)。標(biāo)簽小鼠的蛋白質(zhì)組織表達WB質(zhì)控檢測陽性結(jié)果，表明該蛋白質(zhì)在對應(yīng)組織中表達豐度高。為了確保每個標(biāo)簽小鼠的標(biāo)記正確性，GTP研發(fā)中心后續(xù)會與科學(xué)家保持密切溝通，或自行開發(fā)下游技術(shù)平臺來進行驗證，確保每個標(biāo)簽小鼠都能用于研究。此項工作首次大規(guī)模繪制小鼠蛋白質(zhì)組織圖譜，填補國內(nèi)相關(guān)數(shù)據(jù)的空白，并會持續(xù)進行和升級，細化每個標(biāo)簽小鼠品系的蛋白質(zhì)組織圖譜更新到GTP官網(wǎng)上，為科學(xué)研究提供強有力的自主數(shù)據(jù)支持。

圖3 標(biāo)簽小鼠在11個組織中的WB檢測陽性分布圖

從8周齡以上的雄性標(biāo)簽小鼠身上分離腦、肝、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、肺、腸、胸腺、白色脂肪和睪丸11個器官組織，利用HA或其他對應(yīng)標(biāo)簽抗體進行WB分析，其中組織WB結(jié)果出現(xiàn)陽性信號的共有160個品系。圖中顯示在這160個品系的標(biāo)簽小鼠中，攜帶標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分別在11個組織中內(nèi)源性表達的分布情況及其比例。

6 技術(shù)開發(fā)與服務(wù)

經(jīng)過3年的努力，GTP研發(fā)中心已建立了初具規(guī)模的特色標(biāo)簽產(chǎn)品戰(zhàn)略資源庫，定期在GTP官網(wǎng)上發(fā)布更新標(biāo)簽細胞和標(biāo)簽小鼠的資源庫信息?？蒲腥藛T可登陸官網(wǎng)，查詢并訂購感興趣的標(biāo)簽產(chǎn)品。對于官網(wǎng)上無法搜索到的基因，GTP研發(fā)中心提供專屬訂制服務(wù)，為廣大用戶提供專業(yè)的個性化標(biāo)簽產(chǎn)品。

GTP研發(fā)中心的標(biāo)簽小鼠資源庫，已有242個標(biāo)簽小鼠品系被分發(fā)到3個囯家15個地區(qū)的32個研究機構(gòu)，供66個研究團隊使用，為推動科學(xué)研究和臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化作出了重大貢獻。其中包含22個標(biāo)簽小鼠品系發(fā)貨到國外3個研究機構(gòu)的3個研究團隊，開展國際合作，逐步擴大國際影響力。

基于“人造精子細胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)的強大拓展性，在其他基因改造小鼠的業(yè)務(wù)中具有很強優(yōu)勢，因此GTP研發(fā)中心也將加強市場宣傳推廣，接受各種基因改造小鼠業(yè)務(wù)訂單。在服務(wù)中體現(xiàn)半克隆技術(shù)省時高效的優(yōu)勢，打好口碑，逐步拓展市場，豐富資源庫類別，擴大自主資源庫體量。實現(xiàn)以專業(yè)技術(shù)取勝，充分發(fā)揮本技術(shù)優(yōu)勢，聚焦高端用戶的高難度模型小鼠構(gòu)建，解決用戶現(xiàn)有科研難題，推動基因改造小鼠行業(yè)發(fā)展，實現(xiàn)科學(xué)研究理論創(chuàng)新和技術(shù)突破。

7 結(jié)語與展望

GTP研發(fā)中心利用自主知識產(chǎn)權(quán)的“人造精子細胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)來大規(guī)模生產(chǎn)基因改造細胞和小鼠，具有技術(shù)首創(chuàng)性。并且建立了全新種子戰(zhàn)略資源，主打標(biāo)簽細胞和標(biāo)簽小鼠戰(zhàn)略資源，促進蛋白質(zhì)功能研究，具有資源全球獨特性。在3年的發(fā)展歷程中，GTP研發(fā)中心已證明GTP技術(shù)的可行性和優(yōu)越性，也在一步步以專業(yè)性打造全新蛋白質(zhì)研究工具的戰(zhàn)略資源庫。JAX目前是全球最大的基因改造小鼠品系供應(yīng)商，是全球?qū)嶒炐∈蟆包S金標(biāo)準(zhǔn)”，擁有優(yōu)秀遺傳純度和遺傳穩(wěn)定性，以豐富的基因型與表型數(shù)據(jù)享譽世界。在后續(xù)發(fā)展中，GTP研發(fā)中心將對標(biāo)行業(yè)尖端，秉承“實事求是、獨立自主、科技為本”的原則，積極努力走向產(chǎn)業(yè)化。在市場化運營過程中持續(xù)優(yōu)化生產(chǎn)體系，降低成本，提高核心技術(shù)人員業(yè)務(wù)水平。同時吸收市場化企業(yè)的經(jīng)驗，提升創(chuàng)新積極性，增強產(chǎn)品市場競爭力，著實提高自身的行業(yè)競爭力，努力打造中國JAX。全力開發(fā)獨有標(biāo)簽產(chǎn)品戰(zhàn)略資源，優(yōu)先支撐我國科學(xué)家進行創(chuàng)造性蛋白質(zhì)組功能研究，將全基因組的蛋白研究提升到新高度，并作為關(guān)鍵基礎(chǔ)提出重大科學(xué)問題，培育一系列前沿?zé)狳c，加快國內(nèi)科研隊伍的建設(shè)，推動國際生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，做出中國科學(xué)家的貢獻，引領(lǐng)國際生命科學(xué)研究模式，帶動一系列產(chǎn)業(yè)化平臺建設(shè)和臨床應(yīng)用，最終改善人類健康。

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Construction of genome-wide protein tagging cell and mouse libraries

Jing Jiang, Anqi Zhao, Tian Xie, Shuwei Chen, Jinsong Li

Mice are the most widely used model organism for the study of gene functions and disease mechanisms through the generation of gene-modified mice. Since the 1980s, different genetic manipulation technologies have been developed to reveal gene functions, including homologous recombination strategies mediated by embryonic stem cells, transgenic strategies mediated by gametes, and the latest genetic modification strategies based on CRISPR/Cas9 technology. Semi-cloning technology mediated by “artificial spermatids” (androgenetic haploid embryonic stem cells, also termed sperm-like stem cells) is developed by Chinese scientists in 2012. In combination with CRISPR/Cas9, semi-cloning technology enables one-step generation of gene-modified mice through injection of “artificial spermatids” with specific gene modifications into oocytes. It has the characteristics of short construction cycle, high efficiency, low cost, and high application compatibility. In 2017, the Center for Excellence in Molecular Cell Science (CEMCS) of CAS has launched the genome tagging project (GTP) based on “artificial spermatid”-mediated semi-cloning technology. The ambitious goal of GTP is to tag every protein in mice and construct a unique mouse library that maintains the genome-wide protein-tagging mouse models. Subsequently, the GTP center was established at CEMCS to pursue the project. GTP center developed strategies to generate protein-tagging cells and mice. Briefly, a tag sequence is precisely inserted in a specific protein- coding gene endogenously in cultured “artificial spermatids”to build a cell library, in which, each cell line carrying a specific protein tag. The tagged cells could be further used as a sperm replacement to produce tagged mice in one step upon injection into oocytes. The tagged mouse library enables global analysis of protein expression, localization, and complexes using standard tag-based assays. By April 2021, the GTP center has generated 1532 tagged cell lines, 277 of which have been successfully used to produce tagged mice through oocyte injection. A total of 242 tagged mouse strains have been distributed to 66 research teams in 32 research institutions of 15 districts in 3 countries. The database of tagging product resources has been established and released regularly on the GTP website for scientists to inquire and order. Later, more information about GTP products, such as mouse breeding, protein tissue expression map, published literature, etc., will also be successively published on the GTP website. The GTP center will provide a standardized platform for protein function research, which may dramatically promote the development of life science and clinical transformation.

genome tagging project; artificial spermatid; semi-cloning technology; protein tagging mouse; strategic resource

2021-04-29;

2021-06-07

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技創(chuàng)新行動計劃項目(編號：17411954900和19411951800)，中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(編號：XDB19010204)和國家自然科學(xué)基金項目(編號：31801057)資助[Supported by Shanghai Municipal Commission for Science and Technology Grants (Nos. 17411954900, 19411951800), the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No. XDB19010204), and the National Natural Science Foundation of China (No. 31801057)]

蔣婧，博士，副研究員，研究方向：基因組標(biāo)簽計劃。E-mail: jiangjing@sibcb.ac.cn

10.16288/j.yczz.21-163

2021/6/25 13:30:57

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210625.1238.003.html

(責(zé)任編委: 徐瓔)