孔令粵，劉佳鑫，郭 放，郭 濤，馮安妮，趙仕滔，黃浚煒，劉新光，趙 煒△

1.廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所，廣東東莞 523808；2.廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808；4.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東東莞 523808；5.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808

早老癥(HGPS)是由于A型核纖層蛋白的編碼基因(LMNA)發(fā)生突變[1-3]，產(chǎn)生異常剪接的蛋白(早老素)，在細(xì)胞核內(nèi)堆積引發(fā)的具有早老特征的疾病[4]。研究發(fā)現(xiàn)，使用自噬誘導(dǎo)劑蛋白酶體抑制劑(MG132)處理HGPS患者的成纖維細(xì)胞，可以有效改善細(xì)胞的早老表型[5],暗示LMNA基因和細(xì)胞自噬之間存在一定的聯(lián)系，但是具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。人的唯鐵脫氫酶編碼基因1(IOP1)是一種鐵硫蛋白，主要參與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中鐵硫蛋白的合成[6]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)LMNA和IOP1之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系，本研究著重探討兩者之間，特別是它們?cè)诩?xì)胞自噬中潛在的調(diào)控機(jī)制，希望為HGPS的治療提供借鑒。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料 人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)為本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine RNAiMAX、IOP1-siRNA (ID:HSS148890)、LMNA-siRNA (ID:HSS106094)及50 nmol/L陰性對(duì)照NC-siRNA (12935400)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser) 購自日本Takara公司。RIPA裂解液、PMSF、 5×Loading Buffer 均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司。TGX Stain-Free FastCast Acrylamide試劑盒購自美國Bio-Rad公司，0.2 μmol/L PVDF膜購自德國Merck Millipore公司，牛血清清蛋白(BSA)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，AP標(biāo)記二抗購自美國Proteintech公司，NBT/BCIP購自美國Sigma公司。IOP1抗體、Lamin A/C抗體、LC3BⅠ抗體、LC3BⅡ抗體、FOXO3a抗體、p62抗體、ATG5、ATG12抗體、GAPDH抗體均購自美國CST公司。熒光定量PCR儀型號(hào)為LightCycler 480，購自瑞士羅氏公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2siRNA干擾實(shí)驗(yàn) 將HEK293T接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L 的IOP1-siRNA、LMNA-siRNA及50 nmol/L陰性對(duì)照NC-siRNA。用于提取總RNA的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h收集，用于提取總蛋白的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后96 h收集。

1.2.3熒光定量PCR 采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR，先使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,按照cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)的操作說明，取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后采用SYBR Green法在LightCycler 480儀器上進(jìn)行熒光定量PCR。IOP1基因的定量引物序列為5′-GAA AAA AGG GCG GGA AGT GPC R-3′和5′-GCT CCC GTC ATC TTC AAT GC-3′，LMNA基因的定量引物序列為5′-TGG ACG AGT ACC AGG AGC TT-3′和5′-ACT CCA GTT TGC GCT TTT TG-3′，內(nèi)參基因GAPDH的定量引物序列為5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3′和5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min預(yù)變性；95 ℃ 5 s變性，55 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸；循環(huán)數(shù)40次。

1.2.4Western Blotting 收集細(xì)胞后，加入RIPA裂解液及PMSF，冰上裂解30 min，加入5×Loading Buffer，100 ℃水浴10 min。使用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide試劑盒配制12% PAGE膠,電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.2 μmol/L PVDF膜,3% BSA室溫封閉1 h后，加入一抗，4 ℃孵育過夜，1×TBST漂洗3次后，加入AP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。通過NBT/BCIP法顯色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1在HEK293T中干擾LMNA的表達(dá)對(duì)IOP1和細(xì)胞自噬的影響 有文獻(xiàn)報(bào)道在小鼠中敲除LMNA基因后，細(xì)胞自噬的標(biāo)志物之一LC3BⅡ/LC3BⅠ的比例上調(diào)[7]。為了在細(xì)胞水平研究LMNA與自噬的關(guān)系，本文在HEK293T中轉(zhuǎn)染靶向LMNA基因的siRNA，進(jìn)而檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的表達(dá)水平。熒光定量PCR分析結(jié)果見圖1A，與NC對(duì)照組相比，在轉(zhuǎn)染了靶向LMNA基因siRNA的實(shí)驗(yàn)組中，LMNA的mRNA干擾效率達(dá)到85%。LMNA蛋白水平明顯下調(diào)，見圖1B。

本文進(jìn)一步通過Western Blotting檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的相對(duì)比例(圖1B)，結(jié)果顯示，與NC對(duì)照組相比，LC3BⅡ/LC3BⅠ的比例上調(diào)，表明在HEK293T中下調(diào)LMNA基因的表達(dá)水平，可以上調(diào)細(xì)胞的自噬水平。轉(zhuǎn)染了靶向LMNA基因的siRNA的HEK293T中，IOP1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都明顯下調(diào)，這表明LMNA基因、IOP1基因和自噬之間可能存在調(diào)控關(guān)系。

注：與NC對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2在HEK293T中干擾IOP1的表達(dá)對(duì)LMNA基因的影響 鑒于在HEK293T中干擾LMNA基因的表達(dá)，IOP1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都明顯下調(diào)，本文在HEK293T中轉(zhuǎn)染靶向IOP1基因的siRNA，進(jìn)而檢測LMNA基因的表達(dá)水平。與NC對(duì)照組相比，在轉(zhuǎn)染了靶向IOP1的siRNA的實(shí)驗(yàn)組中，IOP1基因的mRNA(圖2A)和蛋白水平明顯下調(diào)，見圖2B。然而，LMNA基因的mRNA和蛋白水平都沒有明顯改變。結(jié)果表明，在HEK293T中干擾IOP1基因的表達(dá)不影響LMNA基因的表達(dá)水平。

注：與NC對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3在HEK293T中干擾IOP1基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞自噬的影響 為了進(jìn)一步研究LMNA基因、IOP1基因和自噬之間潛在的調(diào)控關(guān)系，本文在轉(zhuǎn)染了靶向IOP1基因siRNA的HEK293T中(IOP1基因的表達(dá)水平被證實(shí)下調(diào)，圖3A)，通過Western Blotting檢測多個(gè)細(xì)胞自噬的標(biāo)志物：LC3BⅡ/LC3BⅠ、p62、ATG5-ATG12復(fù)合體、ATG5和ATG12。結(jié)果顯示(圖3B)，LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值升高，F(xiàn)OXO3a、ATG5、ATG12、ATG5-ATG12復(fù)合體蛋白水平升高，p62蛋白水平略有降低，暗示細(xì)胞的自噬水平上升。

注：與NC對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討 論

鐵硫蛋白是以鐵原子和硫原子組成的鐵硫簇為輔基的一大類蛋白，參與眾多生理過程，如細(xì)胞代謝、呼吸鏈電子傳遞、DNA合成修復(fù)以及基因表達(dá)調(diào)控等[8]。有研究報(bào)道，在人乳腺癌細(xì)胞和小鼠細(xì)胞中沉默鐵硫蛋白NAF-1的表達(dá)，可以激活自噬[9]；鐵硫蛋白NEET蛋白參與信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、自噬等多種細(xì)胞活動(dòng)[10]。這些研究提示，鐵硫蛋白很可能在細(xì)胞自噬中起著重要作用。但是，IOP1基因作為鐵硫蛋白家族中的一員，是否參與調(diào)控調(diào)細(xì)胞自噬，鮮見相關(guān)報(bào)道。

有研究報(bào)道，在二倍體釀酒酵母中缺失NAR1基因(人類IOP1基因在酵母中的同源基因) 的一個(gè)拷貝，會(huì)明顯縮短酵母的復(fù)制性壽命，表明NAR1及其人類同源基因IOP1基因很可能在細(xì)胞衰老中起重要作用[11]。另外，IOP1基因的另一個(gè)人類同源基因IOP2(也叫NARF)能與A型核纖層蛋白前體相互結(jié)合[12]，LMNA基因突變會(huì)導(dǎo)致以HGPS為代表的一系列核纖層蛋白疾病。研究發(fā)現(xiàn)，核纖層蛋白病的細(xì)胞樣本中都存在細(xì)胞自噬受損現(xiàn)象，使用mTOR藥物抑制劑(可以激活自噬)處理后可以有效緩解細(xì)胞病理的相關(guān)表型[5]。

本文在HEK293T中轉(zhuǎn)染靶向LMNA基因的siRNA之后，細(xì)胞自噬的標(biāo)志物之一LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值上調(diào),同時(shí)，IOP1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都明顯下調(diào)，這表明下調(diào)LMNA基因的表達(dá)，可以有效降低IOP1基因的表達(dá)水平，反之，下調(diào)IOP1基因的表達(dá)，不會(huì)影響LMNA基因的表達(dá)水平。這表明LMNA基因?qū)OP1基因存在單向的調(diào)控關(guān)系。

為了進(jìn)一步探討IOP1基因是否也參與調(diào)控細(xì)胞自噬，本研究在HEK293T中轉(zhuǎn)染靶向IOP1基因的siRNA，直接降低IOP1基因的表達(dá)水平，進(jìn)而檢測自噬標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值、FOXO3a、ATG5、ATG12、ATG5-ATG12復(fù)合體蛋白水平升高，p62蛋白水平略有降低。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，LC3蛋白可以被ATG4剪切形成LC3-Ⅰ，誘導(dǎo)自噬后，LC3-Ⅰ通過ATG7、ATG3和ATG12-ATG5-ATG16L多聚體與高親脂性磷脂酰乙醇胺(PE)部分結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型LC3(即LC3-Ⅱ)。因此，LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白比值越大，提示自噬水平越高。p62是LC3-Ⅱ的自噬底物蛋白，與LC3Ⅱ呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[13]。

FOXO3a是FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在細(xì)胞衰老、凋亡、自噬中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3A可以直接與自噬相關(guān)基因的啟動(dòng)子，例如LC3B、ATG12結(jié)合，進(jìn)而激活細(xì)胞自噬，減緩環(huán)境壓力對(duì)細(xì)胞的毒害作用[14-16]。

綜合這些細(xì)胞自噬標(biāo)志物的檢測結(jié)果，本文推測在HEK293T中干擾LMNA基因的表達(dá)后，可能通過下調(diào)IOP1基因的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致自噬相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，在HEK293T中LMNA基因可以調(diào)控IOP1基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞自噬過程。而LMNA基因通過何種途徑調(diào)控IOP1基因的表達(dá)，是直接調(diào)控，還是通過其他信號(hào)通路間接調(diào)控，相關(guān)的分子機(jī)制尚需要更深入的研究。