俞 萍 岳煜賢E - 張 宇 陳長(zhǎng)寶 - 張慶賀 -

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根莖，含有多種人體所必需的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，具有較高的藥用價(jià)值，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥[1]。近年來，人參被列為新資源食品，其系列產(chǎn)品有人參糖蛋白腸溶膠囊、人參蛋白片、人參黑木耳多糖粉以及人參紅景天鹿茸保健酒等[2-5]。人參中發(fā)揮多重藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要有皂苷、糖蛋白、糖肽、多糖、多肽、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油等成分[6]；其中糖蛋白類成分被證明具有許多生物活性，如增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞以及抗炎鎮(zhèn)痛等[7-8]。由于糖蛋白具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和潛在保健作用與藥效，成為了繼多糖之后的研究熱點(diǎn)[9]。

糖蛋白作為一種結(jié)合蛋白，兼具蛋白質(zhì)和多糖的部分性質(zhì)，因此其提取方法多根據(jù)蛋白質(zhì)與多糖的性質(zhì)進(jìn)行提取。目前，天然糖蛋白的提取方法主要有水提法、醇提法、稀鹽溶液或緩沖溶液提取法、酸堿溶液提取法、超聲波輔助法以及微波輔助法等，其中以水提法與超聲輔助法應(yīng)用較多[10-13]。水提法與超聲輔助法均具有操作工藝簡(jiǎn)單、引入雜質(zhì)相對(duì)較少、成本低廉、條件控制方便等優(yōu)點(diǎn)，但水提法的提取率更高，且更適用于工業(yè)化生產(chǎn)[14]。糖蛋白的分離方法主要有Sevage法、乙醇沉淀法、堿提酸沉法、硫酸銨沉淀、超濾法、柱色譜法等，其中乙醇沉淀法和柱色譜法常用于水提法分離[15-16]，而乙醇沉淀法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)易得，適用于糖蛋白粗提取物的工業(yè)化生產(chǎn)。目前有關(guān)人參糖蛋白制備工藝的研究較少，且方法較為單一、提取率低，一般約為5.5%～12.6%[17-18]。

課題組在前期試驗(yàn)中初步比對(duì)了煎煮法、浸漬法、回流提取法和酶解法4種糖蛋白類成分常用提取方法提取人參糖蛋白，其中煎煮法的提取率最高，在此基礎(chǔ)上，研究擬以煎煮法為提取方法，水提醇沉法為分離方法，通過響應(yīng)面法優(yōu)化人參糖蛋白的制備工藝，為人參糖蛋白的開發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5年生人參：經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)陳長(zhǎng)寶教授鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根莖，吉林省怡生對(duì)外貿(mào)易有限公司；

濃硫酸：分析純，太原化肥廠化學(xué)試劑廠；

苯酚：分析純，四川佰春科技有限責(zé)任公司；

葡萄糖：分析純，常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

95%乙醇：分析純，無錫市晶科化工有限公司；

氯化鈉注射液：辰欣藥業(yè)股份有限公司；

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：增強(qiáng)型，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機(jī)：BG-1001型，中山市長(zhǎng)柏電器實(shí)業(yè)有限公司；

電子天平：JM-A2002型，余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電磁爐：IH-H208C型，佛山市富士寶電器科技股份有限公司；

增力電動(dòng)攪拌器：JJ-1型，江蘇金壇市江南儀器廠制造證；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELA N-1100型，東京理化器械株式會(huì)社；

凍干機(jī)：EYELA-FDU2100型，東京理化器械株式會(huì)社；

電子天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

EYELA油浴鍋：0SB-2100型，上海愛朗儀器有限公司；

酶標(biāo)儀：M200pro型，瑞士TECAN集團(tuán)公司；

振蕩培養(yǎng)箱：ZQZY-85CNS型，上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參糖蛋白的提取

人參粗粉→浸泡→煎煮、過濾→合并濾液、濃縮→醇沉→抽濾→沉淀→冷凍干燥→人參糖蛋白

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1) 提取時(shí)間：固定提取次數(shù)3次，料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1∶14 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，考察提取時(shí)間(1，2，3，4，5 h)對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

(2) 提取次數(shù)：固定提取時(shí)間1 h，料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1∶14 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，考察提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

(3) 料液比：固定提取次數(shù)3次，提取時(shí)間1 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，考察料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)[1∶8，1∶14，1∶20，1∶26，1∶32 (g/mL)]對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

(4) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定提取次數(shù)3次，提取時(shí)間1 h，料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1∶14 (g/mL)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%，60%，70%，80%，90%)對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)[19]，平行3次。

1.3.4 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)文獻(xiàn)[20]并修改。精密吸取0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于離心管中，加超純水補(bǔ)充至100 μL，混勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%苯酚溶液100 μL，緩緩加入濃硫酸500 μL，混勻，100 ℃水浴5 min，待水浴鍋中溫度降至室溫，取出。精密吸取200 μL置于96孔板中，以超純水為空白，測(cè)定490 nm處吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程y=5.171 6x+0.148 4，R2=0.999。

(2) 樣品溶液的測(cè)定：取人參糖蛋白粉配制成0.1 mg/mL 的樣品溶液，測(cè)定490 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(1)

式中：

W1——多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

C——樣品溶液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m1——粗提物質(zhì)量，g；

m2——樣品溶液的質(zhì)量，g；

m3——原料質(zhì)量，g。

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 采用BCA法[21]。按式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

(2)

式中：

W2——蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

C——樣品溶液中蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m1——粗提物質(zhì)質(zhì)量，g；

m2——樣品溶液質(zhì)量，g；

m3——原料質(zhì)量，g。

1.3.6 人參糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算 按式(3)進(jìn)行計(jì)算。

W=W1+W2，

(3)

式中：

W——人參糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 各指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次，采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析，并通過prism7.0、Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間 由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。這可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，雜質(zhì)大量溶出并且使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降，不利于蛋白質(zhì)溶出，因此最適提取時(shí)間為1 h。

2.1.2 提取次數(shù) 由圖2可知，隨著提取次數(shù)的延長(zhǎng)，多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均升高，提取3次后，多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。提取次數(shù)過多，提取物中黏液質(zhì)等其他水溶性雜質(zhì)含量升高，主成分含量反而降低，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.1.3 料液比 由圖3可知，隨著料液比的增大，多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均先增加后降低，當(dāng)料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為 1∶14 (g/mL)時(shí)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；當(dāng)料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為 1∶20 (g/mL)時(shí)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。這可能是由于液料比的增加，使原料與浸提液的接觸面積增大，目標(biāo)成分充分溶出，而當(dāng)料液比增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)和多糖溶出達(dá)到平衡，而雜質(zhì)擴(kuò)散相對(duì)增多。因此，選擇最適料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為1∶14 (g/mL)。

圖1 提取時(shí)間對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖2 提取次數(shù)對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖4可知，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先增加后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。這可能與多糖和蛋白質(zhì)的溶解性有關(guān)，二者對(duì)高濃度醇的親和力不同，且乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，沉淀出的非糖類成分增多，提取物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。綜上，選擇最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化人參糖蛋白制備工藝

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn) 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以人參糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表 1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

圖3 料液比對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)人參糖蛋白中多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合，得回歸模擬方程：

Y=5.209 83+0.655 67A+4.026B+0.739 39C+0.192 6D+0.02AB+0.010 417AC+0.022AD-0.002 5BC+0.000 75BD+0.000 583 333CD-0.732 25A2-0.677 25B2-0.025 757C2-0.001 672 5D2。

(4)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析?

2.2.2 交互作用分析 由圖5可知，提取時(shí)間與料液比、提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用極顯著(P<0.01)，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后得到人參糖蛋白制備的最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間1.68 h、提取次數(shù)3.01次、料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)1.00∶15.37 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.99%，此條件下預(yù)測(cè)的人參糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.43%。為方便實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為：提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)3次、料液比(m人參粗粉∶V蒸餾水)為 1.0∶15.4 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，經(jīng)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，人參糖蛋白的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.14%，與預(yù)測(cè)值基本一致，較文獻(xiàn)[17-18，22-23]有明顯的提高，證明該模型優(yōu)化的人參糖蛋白的制備工藝準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定可行。

圖5 各因素間交互作用對(duì)人參糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

3 結(jié)論

采用煎煮法提取，乙醇沉淀法分離，并運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化了人參糖蛋白制備工藝。結(jié)果表明，人參糖蛋白最佳制備工藝參數(shù)為提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)3次、料液比 (m人參粗粉∶V蒸餾水)為1.0∶15.4 (g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，此條件下人參糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)24.14%。后續(xù)可通過色譜技術(shù)等方法對(duì)人參糖蛋白進(jìn)行純化，以提高其純度；還可對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性機(jī)制進(jìn)行研究。