閆順華 - 王亞麗 - 夏依拉·艾尼--·-

(新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院,新疆 烏魯木齊 830054)

磺胺類藥物廉價且高效，主要用于生豬的疾病防治，甚至作為飼料添加劑用來促生長或增產(chǎn)[1-2]，但過量使用會在豬肉中殘留。研究顯示，磺胺類藥物代謝時間長且有蓄積，長期攝入含有此類藥物的食品，會引起過敏反應(yīng)以及引發(fā)泌尿系統(tǒng)、肝臟損傷[3]；一些磺胺類藥物還會影響造血功能，從而引發(fā)癌癥[4]。

測量不確定度是“根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負(fù)參數(shù)”[5]，是評價實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果質(zhì)量優(yōu)劣或可信程度的定量指標(biāo)[6]。目前，關(guān)于畜禽肉類中磺胺類藥物殘留量檢測方法的研究較多，但與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，全面地考慮、分析測定豬肉中多種磺胺類藥物過程的不確定度影響因素的報(bào)道較少。試驗(yàn)擬采用乙腈—水(V乙腈∶V水=100∶3)溶液渦旋振蕩提取，經(jīng)乙腈飽和正己烷萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹濃縮前處理后，應(yīng)用液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法技術(shù)對豬肉中的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺二甲嘧啶的殘留量進(jìn)行測定，并依據(jù)CNAS-GL006《化學(xué)分析不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，分析試驗(yàn)過程中可能引入的各不確定度分量，對豬肉中4種磺胺類藥物的檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評估，旨在為豬肉品質(zhì)評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

磺胺間甲氧嘧啶(SMM)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號00817，純度98.5%)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號81124，純度97.5%)、磺胺甲噁唑(SMZ)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號01118，純度99.0%)、磺胺二甲嘧啶(SM2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號100411，純度99.5%)：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

乙腈：色譜純，德國Merek公司；

正己烷、正丙醇：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

豬肉樣品：國家認(rèn)監(jiān)委提供的能力驗(yàn)證樣品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：API4000型，美國AB公司；

分析天平：AE240型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

分析天平：MS205DU型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-300型，瑞士步琦有限公司；

氮吹儀：Eva50a型，北京普利泰科儀器有限公司；

移液器：20～5 000 μL，北京Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1) 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別精密稱取SMM、SDM、SMZ和SM2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 34，0.010 58，0.010 12，0.011 81 g 置于同一個10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到質(zhì)量濃度(用純度折算后)分別為1 018，1 032，1 002，1 175 μg/mL的SMM、SDM、SMZ和SM2的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

(2) 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：用1.0 mL單標(biāo)線吸量管移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

(3) 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1：用1.0 mL單標(biāo)線吸量管吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液至10 mL容量瓶中，用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1。

(4) 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列：用單標(biāo)線吸量管和微量移液器分別移取5 000，1 000，500，100，50，20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1至6個10 mL容量瓶中，用乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)定容，得到SMM、SDM、SMZ、SM2的6種混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列。

1.2.2 樣品處理 稱取豬肉樣品2 g，加入6 g C18填料，研磨均勻后裝入50 mL離心管中，加入25 mL乙腈—水(V乙腈∶V水=100∶3)溶液，旋渦振蕩1 min，微波輻照30 s，3 000 r/min離心5 min，將乙腈層移入1 000 mL棕色分液漏斗中，用25 mL乙腈飽和正己烷溶液萃取；將底層的乙腈萃取液移入150 mL棕色雞心瓶中，加入10 mL正丙醇，45 ℃水浴減壓蒸發(fā)、氮吹至近干；加入1 mL乙腈—水(V乙腈∶V水=1∶1)溶液復(fù)溶，正己烷脫酯，過膜，待測。

1.2.3 加標(biāo)樣品制備 稱取豬肉空白樣品(陰性樣品)6份(每份2.0 g)，加入6 g C18填料，研磨均勻后，分別裝入50 mL離心管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20 μL，其余步驟同1.2.2樣品前處理。

1.2.4 儀器設(shè)備條件

(1) 液相色譜條件：C18色譜柱Shimadzu shim-pack XRti5-ODS (3.0 mm ×75 cm，5 μm)；柱溫30 ℃，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量10 μL；流動相為乙腈(A)—0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫。

(2) 質(zhì)譜條件：電離模式ESI+；掃描方式MRM；氣簾氣(CUR)0.103 MPa；霧化氣(GS1)0.413 MPa；干燥氣(GS2)0.413 MPa；離子噴霧電壓5 500 V；離子化溫度550 ℃；錐孔電壓(DP)50 V。

1.3 測量數(shù)學(xué)模型

(1)

式中：

X——樣品中各磺胺類藥物殘留量，μg/kg；

C——被測組分溶液的質(zhì)量濃度，ng/mL；

V——樣品溶液定容體積，mL；

m——被測組分的稱樣量，g；

1 000——換算系數(shù)。

2 試驗(yàn)過程中不確定度來源分析

根據(jù)試驗(yàn)步驟和測量數(shù)學(xué)模型，液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定豬肉中4種磺胺類藥物殘留量的不確定度來源如圖1 所示[7-8]。

3 不確定度的評定

3.1 樣品測定引入的不確定度

3.1.2 待測樣品溶液定容引入的不確定度ur(V樣) 樣品定容用的是1 mL移液器，移液器引入的不確定度主要由容量允差、溫度波動和測量重復(fù)性引入。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，移取1 mL溶液時，移液器容量允差為±0.010 mL，測量重復(fù)性為0.5%，按均勻分布估算，則

圖1 液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定豬肉中4種

移取樣品溶液時實(shí)驗(yàn)室溫度為24 ℃，移液器校準(zhǔn)時溫度為20 ℃，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，則產(chǎn)生體積變化的半寬為1 mL×1.37×10-3℃-1×4 ℃=0.005 48 mL，假設(shè)體積變化為均勻分布，則

3.1.3 液質(zhì)聯(lián)用儀引入的不確定度ur(E液質(zhì)) 液質(zhì)聯(lián)用儀的測量重復(fù)性為0.9%，按均勻分布估算，則該儀器測量引入的不確定度為：

則樣品重復(fù)測量引入的不確定度為：

3.1.5 方法回收率引入的不確定度ur(R) 對加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，按式(2)[9]、式(3)[10]計(jì)算回收率引入的不確定度。

(2)

(3)

式中：

S(R)——標(biāo)準(zhǔn)偏差。

根據(jù)t檢驗(yàn)，按式(4)計(jì)算t值,判斷測量結(jié)果的偏差是否顯著[11]。

(4)

計(jì)算結(jié)果見表2。

當(dāng)置信度為95%，n-1=5，查t值臨界值分布表可得：t(0.05, 5)=2.571，與表2中4種磺胺類藥物的t值相比較可知，需要將回收率代入式(1)修正樣品的測定結(jié)果。

表1 樣品測定結(jié)果

表2 回收率測定結(jié)果

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度ur(P對) SMM、SDM、SMZ和SM24種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度分別為98.5%，97.5%，99.0%，99.5%，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%，2.5%，1.0%，0.5%，按均勻分布計(jì)算，不確定度為

3.2.2 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度ur(W對) 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所使用天平的最大允差為0.000 05 g。實(shí)際稱量SMM、SDM、SMZ和SM2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量分別為0.010 34，0.010 58，0.010 12，0.011 81 g。按均勻分布計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度為：

3.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液系列配制過程引入的不確定度ur(V對) 根據(jù)1.2.1可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制過程中使用了單標(biāo)線吸量管(3次1 mL、1次5 mL)、容量瓶(8次10 mL、1次100 mL)和微量移液器(分別量取20，50，100，500 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液各1次)，按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，假設(shè)為均勻分布，則各類玻璃器具引入的不確定度計(jì)算數(shù)據(jù)如表3所示，移液器引入的不確定度計(jì)算數(shù)據(jù)如表4所示。

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制過程中玻璃器具引入的不確定為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制過程中移液器引入的不確定為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列配制引入的不確定度為：

3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度ur(C) 對標(biāo)準(zhǔn)工作液系列進(jìn)行測定(每個濃度點(diǎn)平行測2次)，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量數(shù)據(jù)如表5所示。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作液系列的稀釋濃度，利用線性回歸方程，可計(jì)算得到峰面積的理論值A(chǔ)i，然后計(jì)算出峰面積A實(shí)i的殘差A(yù)實(shí)i-Ai=A實(shí)i-(aCi+b)。由式(5)計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差[11]。

(5)

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中玻璃器具引入的不確定度

式中：

n——標(biāo)準(zhǔn)工作液系列測定的次數(shù)(n=2×7=14)。

則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可按式(6)計(jì)算[12]。

(6)

式中:

P——待測溶液的平行測量次數(shù)，P=10；

C實(shí)i——標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的實(shí)測質(zhì)量濃度，mg/L；

根據(jù)式(5)、式(6)，可計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定，其結(jié)果如表6所示。

3.3 不確定度的合成

3.3.1 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成 按式(7)進(jìn)行計(jì)算，4種磺胺類藥物的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表7所示。

(7)

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線測量數(shù)據(jù)

續(xù)表5

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

表7 不確定度評定結(jié)果

3.3.2 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算 按式(8)、式(9)進(jìn)行計(jì)算[13-14]，4種磺胺類藥物的擴(kuò)展不確度如表7所示。

(8)

(9)

4 結(jié)論

影響樣品檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有很多，如檢驗(yàn)人員的理論知識水平、樣品前處理的經(jīng)驗(yàn)、對試驗(yàn)操作過程的熟練程度，儀器設(shè)備的穩(wěn)定性、試劑耗材的質(zhì)量以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度等各方面，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在檢測開始前對上述所有因素進(jìn)行核查。此外，樣品經(jīng)提取、凈化、濃縮后，定容所用溶劑一般要與進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液所用溶劑一致；定容后溶解是否充分也會對結(jié)果造成一定的影響。因此，實(shí)際操作過程中，應(yīng)使用經(jīng)檢定校準(zhǔn)且滿足檢驗(yàn)方法要求的儀器設(shè)備，加強(qiáng)對試驗(yàn)環(huán)境的控制，不斷提高檢驗(yàn)人員的能力，以有效減少分析結(jié)果的不確定度。