劉 杰

朱曉玲1,2

彭青枝1,2

周陶鴻1,2

龔 蕾1,2

吳婉琴1,2

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430070)

抑郁癥作為一種常見的精神疾病，以情緒低落、快感缺失以及精力不足為核心癥狀，并附加伴隨自卑自責、注意力不集中、睡眠障礙、食欲及體重變化、自殺傾向等[1]其他癥狀。據(jù)世界衛(wèi)生組織定量評價顯示，抑郁癥已成為全球疾病負擔的榜首病種，已超過心血管疾病、癌癥等各大疾病，嚴重損害了人類身心健康和生活質(zhì)量，每年有近80萬人因抑郁癥自殺身亡[2]。

目前，傳統(tǒng)的抑郁癥治療方法多使用抗抑郁藥物進行治療[3]，同時結合心理治療。隨著中國保健食品行業(yè)快速發(fā)展壯大，部分生產(chǎn)企業(yè)非法向產(chǎn)品中添加化學藥物，使其產(chǎn)品具有較好的效果進而吸引消費者。目前，保健食品中抗抑郁藥物測定的品種較少[4-5]，且多采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]，而飛行時間質(zhì)譜作為一類高分辨質(zhì)譜，能夠提供化合物的精確分子質(zhì)量測定，實現(xiàn)化合物的快速定性與定量分析，非常適于復雜基質(zhì)中化合物的快速分析[10-11]。此外，隨著中國各類標準以及國家食品藥品補充檢驗方法的不斷完善[12-15]，食品及保健品中的抗風濕類[15]、減肥類[16-18]、降糖類[19-20]、降壓類[21-22]等非法添加化學物質(zhì)的檢測方法越來越多，但至今尚無抗抑郁類藥物的標準或補充檢驗方法出臺。研究擬采用高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜技術，對保健食品中19種抗抑郁藥物進行研究，建立19種抗抑郁藥物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，通過優(yōu)化前處理方法和色譜質(zhì)譜條件，建立保健食品中抗抑郁藥物的定性及定量檢測方法，旨在為食品安全監(jiān)管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噻奈普?。杭兌?98.0%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

阿莫沙平：純度≥98%，艾吉析科技(上海)有限公司；

去甲替林鹽酸鹽：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

麥普替林、鹽酸丙咪嗪、米氮平、氟西汀、異丙煙肼、舍曲林、阿米替林、度洛西汀、帕羅西汀、氟伏沙明、氯丙咪嗪、奈法唑酮、文拉法辛：100 μg/mL，阿爾塔科技有限公司；

硫酸苯乙肼(MCE)、反苯環(huán)丙胺鹽酸鹽、異唑肼：東莞市迪卡實驗科技有限公司；

乙腈：HPLC級，德國Merck公司；

甲酸：LC-MS級，F(xiàn)isher Scientific(中國)有限公司；

甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用樣品：購于淘寶網(wǎng)以及藥店，樣品信息見表1。

1.2 儀器與設備

飛行時間質(zhì)譜儀：TripleTOF 5600+型，美國ABSCIEX公司；

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國Thermo Fisher公司；

色譜柱：AcclaimTMRSLC 120 C18, 100 mm×2.1 mm，2.2 μm，美國Thermo Scientific公司；

超聲儀：Elmasonic P型，德國 Elma 公司；

離心機：Allegra X-15R型，貝克曼庫爾特有限公司；

超純水器：Milli-Q型，法國密理博公司；

孔徑濾膜：0.22 μm，天津市津騰實驗設備有限公司；

渦旋振蕩器：YALBOYS型，上海安譜科學儀器有限公司；

表1 試驗樣品信息

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 相關溶液的配制

(1) 標準儲備溶液配制：固體標準品(噻奈普汀、阿莫沙平、去甲替林鹽酸鹽、硫酸苯乙肼、反苯環(huán)丙胺鹽酸鹽、異唑肼)，準確稱取按質(zhì)量濃度折算為100%的標準品10.0 mg 于容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL 的單標儲備液，-18 ℃避光保存；液體標準品(麥普替林、鹽酸丙咪嗪、米氮平、氟西汀、異丙煙肼、鹽酸舍曲林、阿米替林、鹽酸度洛西汀、帕羅西汀、氟伏沙明、氯丙咪嗪、奈法唑酮、鹽酸文拉法辛)，準確吸取1 mL于容量瓶中，加入甲醇定容，配制成1.0 mg/mL的單標儲備液，-18 ℃避光保存。

(2) 混合標準工作液：按照各藥物在儀器上的響應強度，各吸取適量單標儲備液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL(噻奈普汀、鹽酸丙咪嗪、米氮平、文拉法辛)，1 000 ng/mL (異丙煙肼)，500 ng/mL(除上述5種化合物之外的其他化合物)的混合標準中間液。用甲醇—水(V甲醇∶V水=10∶90)稀釋混合標準中間液獲得系列標準工作溶液，備用。

(3) 0.1%甲酸水溶液：準確吸取1 mL甲酸，用超純水定容至1 000 mL。

1.3.2 樣品前處理 稱取混合均勻的液體、固體保健食品樣品2.00 g于50 mL離心管中，加入15 mL甲醇，混勻，超聲提取10 min，靜置，離心，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，樣品殘渣中加入8 mL甲醇重復提取一次，合并提取液，用甲醇定容至25 mL，搖勻，吸取2 mL提取液過微孔濾膜，待進樣分析。

1.3.3 液相色譜條件 色譜柱為Thermo Fisher Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件見表2，進樣量5 μL。

1.3.4 TOF/MS工作條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測模式，噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣流速(CUR) 35 L/h；霧化氣流速(GS1) 55 L/h；脫溶劑氣流速(GS2) 55 L/h；一級母離子質(zhì)譜采集范圍m/z100～1 000，高分辨模式，去簇電壓80 V，碰撞能量10 eV。設置母離子強度>100 cps時啟動信息依賴子離子采集，子離子采集質(zhì)譜范圍為m/z50～1 000，高靈敏模式，去簇電壓80 V，碰撞能量(35±15) eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用LibraryView軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用Analyst、PeakView、MasterView軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理。所采集的樣品數(shù)據(jù)運用建立好的數(shù)據(jù)庫進行匹配篩查分析，并采用MultiQuant軟件對所篩查出的陽性化合物進行定量分析。

表2 HPLC梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 數(shù)據(jù)庫的建立

對19種抗抑郁藥物進行高分辨質(zhì)譜一級全掃描和二級碎片離子掃描，得到19種化合物的一級母離子、二級碎片離子、質(zhì)量偏差和保留時間信息，將所得到的信息導入LibraryView數(shù)據(jù)庫軟件中，建立19種抗抑郁藥物的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并同時輸入19種化合物的名稱、分子式、CAS號等信息，各化合物的譜庫信息見表3，可應用于樣品采集數(shù)據(jù)的篩查匹配，降低出現(xiàn)假陽性結果的概率，提高定性結果的可信度。

2.2 樣品提取條件優(yōu)化

試驗表明，以甲醇—水混合溶液作為提取溶劑時，樣品提取液顏色較深，提取出了更多的雜質(zhì)成分，不利于儀器的維護保養(yǎng)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析；以乙腈和甲醇作為提取溶劑時，均能將樣品中的目標化合物進行有效提取，但鑒于乙腈的價格與毒性均高于甲醇，因此最終選擇甲醇作為樣品的提取溶劑。

2.3 色譜條件優(yōu)化

試驗發(fā)現(xiàn)，以0.1%甲酸水溶液與乙腈溶液進行梯度洗脫，19種目標化合物均可獲得良好的峰形，表明甲酸水溶液—乙腈流動相體系適合于19種目標化合物的分離。

表3 19種化合物的CAS號、分子式及相關質(zhì)譜信息

由于麥普替林與阿米替林兩種化合物具有相同的分子式(C20H23N)，一級母離子均為加氫峰(m/z:278.190 3)，僅通過高分辨一級質(zhì)譜信息無法將兩種化合物進行區(qū)分，因此對流動相洗脫梯度條件進行優(yōu)化，最終確定了表2中的梯度程序，麥普替林和阿米替林的提取離子色譜圖見圖1，麥普替林和阿米替林兩種化合物能基本分離，出峰時間分別為9.87，9.99 min，在此基礎上可同時利用兩種化合物的二級高分辨質(zhì)譜信息進行目標物的確證。在優(yōu)化的流動相梯度條件下，19種目標化合物的提取離子色譜圖如圖2所示。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

對化合物的二級特征碎片離子進行優(yōu)化選擇，19種化合物中除麥普替林和阿米替林外，均以二級質(zhì)譜碎片中響應較高的兩對子離子作為定性匹配離子對，由于麥普替林和阿米替林兩種化合物所產(chǎn)生的二級碎片中(圖3和圖4)均包含91.053 8，117.070 2，178.077 4，191.086 4子離子，因此選擇兩種化合物的差異子離子作為特征二級碎片離子，阿米替林的特征碎片子離子為233.134 1，麥普替林的特征碎片子離子為250.157 7。

圖2 19種目標化合物的離子色譜圖

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系和檢出限 由表4可知，19種抗抑郁藥物在5～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.988 7～0.999 9，檢出限為0.2～2.0 μg/kg。

2.5.2 回收率和精密度 試驗表明，19種化合物的回收率為81.2%～98.6%，RSD為0.9%～6.7%，表明試驗方法的準確度和重復性良好，能應用于保健食品中19種抗抑郁藥物的檢測分析。

2.6 樣品測定

應用所建立的方法對20批次市售保健食品進行篩查檢測，19種化合物均未檢出。對阿莫沙平加標陽性樣品進行檢測，并采用所建立的一級、二級譜庫進行結果篩查，可提取出質(zhì)荷比(m/z)為314.106 0的化合物，該化合物保留時間為9.12 min(圖5)，與標準溶液中阿莫沙平藥物的出峰時間一致。對樣品的二級質(zhì)譜圖(圖6)進行分析，加標樣品中目標化合物的2個響應強度較高的碎片離子分別為271.064 4，297.079 4，與阿莫沙平定性離子對吻合，表明所建立的方法可用于樣品中目標化合物的篩查分析。

圖3 麥普替林的二級質(zhì)譜圖

圖4 阿米替林的二級質(zhì)譜圖

圖5 樣品中阿莫沙平提取離子色譜圖

表4 各化合物的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍和檢出限

圖6 樣品中阿莫沙平二級碎片離子與譜庫匹配鏡像圖

3 結論

建立了利用高效液相色譜—四極桿—飛行時間質(zhì)譜技術篩選、確證及定量測定保健食品中19種抗抑郁藥物的分析方法。結果表明，該方法前處理簡單、選擇性高、準確、快速，所建立的19種抗抑郁藥物精確相對分子質(zhì)量一級數(shù)據(jù)庫和二級碎片數(shù)據(jù)庫，可較好地用于實際樣品的高效篩選分析。但試驗研究的非法添加藥物種類仍然有限，后續(xù)應不斷完善補充數(shù)據(jù)庫。