陽辛鳳

王 盼3,4

郭曉杰1,3

楊 磊3,4

李 瓊4

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，海南 ?？?571101；2. 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南 ?？?571101；3. 海南大學熱帶作物學院，海南 ?？?570000；4. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?571101)

火龍果是多年生攀緣植物，主要來源于仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)和蛇鞭柱屬(Selenicereus)[1-4]?；瘕埞麑嵉墓夂凸ひ榔贩N不同呈多種顏色，如紅色、白色、紫色、紫紅、粉色、紅白雙色、橙色、黃色等。依據(jù)果皮與果肉顏色，火龍果果實主要分為紅皮紅肉型(RR)、紅皮白肉型(RW)和黃皮白肉型(YW)3類。研究[5-8]表明火龍果果實的天然色素屬于甜菜苷類色素(Betalains，BLs)。BLs為含氮水溶性色素，主要分布于甜菜、莧菜、千日紅、仙人掌和火龍果等植物中[1,5,9]。依據(jù)結(jié)構(gòu)不同，BLs分為甜菜紅色素(BCs)和甜菜黃色素(BXs)兩大類[4,9]。已報道的BLs有80余種，其中BCs和BXs分別為 46,36種[10-12]。BLs具有廣泛的生物活性，如抗氧化[1,12]、抗炎[13-14]、抗焦慮[15-16]、心血管疾病預防等[17-19]。Dong等[8]從量天尺屬H.polyrhizus的RR及RW果實中共鑒定了23種BLs，Leticia等[16]從綠柱屬火龍果Stenocereuspruinosus果實的紅色果肉和橙色果肉及S.stellatus果實的紅色果肉和白色果肉中共鑒定了11種BLs。目前有關火龍果果實BLs組分構(gòu)成及其在果肉、果皮部位的分布特征的研究尚未見報道。研究擬采用超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜法對不同類型火龍果果實和不同部位(果肉、果皮)中的BLs進行篩查和結(jié)構(gòu)確證，分析BLs的組分構(gòu)成與空間分布，為火龍果BLs天然色素資源和生物活性產(chǎn)物的加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟火龍果：金都一號(RR型)、越南白肉(RW型)、無刺黃龍(YW型)，市售；

甲醇、乙腈：質(zhì)譜純，德國默克公司；

甲酸：色譜純，美國Fisher公司；

鹽酸：分析純，廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜儀：Triple TOF 5600+型，安裝有Analyst?TF 1.6 工作站、PeakView?2.0軟件，美國AB SCIEX公司；

電子天平：ME204型，感量0.1 mg，瑞士梅特勒—托利多公司；

電子天平：JJ500型，感量0.01 g，江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；

冷凍干燥機：LGJ-10D型，北京四環(huán)起航科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 將火龍果果實果皮和果肉分離，切塊，勻漿，于-50 ℃冷凍干燥15 h，得凍干樣品。稱取果皮、果肉凍干樣品5.00 g，用50 mL體積分數(shù)為80%的甲醇水超聲提取2次，每次20 min，合并提取液。12 000 r/min離心10 min，收集上清液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL左右，轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶并定容。過0.22 μm微孔濾膜，待上機。

1.3.2 測試條件 Agilent Poroshell SBAq色譜柱 (2.1 mm×50 mm，2.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)—乙腈 (B)，梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～10 min，2%～30% B；10～17 min，30%～90% B；17～18 min，90%～2% B；18～20 min，2% B；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。ESI離子源，電噴霧正離子模式，離子源電壓5 500 V，離子源溫度550 ℃，霧化氣379 kPa， 輔助氣379 kPa，氣簾氣241 kPa，去簇電壓80 V，碰撞能量35 eV，能量擴展±15 eV，TOF-MS掃描范圍80～1 200，Product Ion掃描范圍50～1 000。掃描方式為IDA模式，開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。采用AB Sciex公司的CDS質(zhì)量校正系統(tǒng)在線校正。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 采取靶向檢索與非靶向檢索策略相結(jié)合進行火龍果果實樣品中BLs的篩查與確證。

(1) 靶向檢索：通過查詢資料和PubChem、ChemSpider、Nist等數(shù)據(jù)庫信息，建立包含102個BLs組分及其生物合成前體物的列表，包括英文名稱、CAS號、分子結(jié)構(gòu)式、分子量、二級碎片離子質(zhì)荷比(m/z)等信息，將該列表導入PeakView軟件。Analyst軟件對樣品信息進行采集，包括一級質(zhì)譜信息與二級碎片信息。采集的數(shù)據(jù)導入PeakView進行檢索，依據(jù)測定相對分子質(zhì)量與理論精確相對分子質(zhì)量的偏差小于5×10-6的原則以及同位素匹配結(jié)果，確定各色譜峰的成分歸屬，并進一步對二級碎片進行分析，根據(jù)碎片離子信息推斷各色譜峰所對應未知物的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)樣品中BLs的篩查與確證。

(2) 非靶向檢索：采集的數(shù)據(jù)導入PeakView進行非靶向檢索，對檢索結(jié)果進行分析，如果色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)與同位素偏差均小于5×10-6，且母離子被打碎生成的二級碎片離子有BLs的共有特征離子，如m/z551,389,345,507等，則初步判定該未知物屬于BLs類化合物，然后根據(jù)PeakView給出的分子式到PubChem、ChemSpider、Nist等數(shù)據(jù)庫中進行檢索與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果甜菜苷類色素組分構(gòu)成

由表1可知，3種類型火龍果果實的果肉、果皮中共鑒定了19種BLs組分，其中BCs和BXs分別為15,4種。15種BCs組分分別為：甜菜苷(betanin)、甜菜苷配基(betanidin)、莧菜紅苷(amaranthin)、丙二酰甜菜苷(phyllocactin)、脫羧丙二酰甜菜苷(decarboxylated phyllocactin)、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷(neophyllocactin)、脫羧新甜菜苷(decarboxylated neobetanin)、千日紅苷-III(gomphrenin-III)、6'-O-malonyl-2-descarboxylated-betanin、hylocerenin、2-decarboxylated hylocerenin、2'-(5''-O-E-feruloylapiosyl) betanin和bougainvillein-R-I。4種BXs 組分分別為：梨果仙人掌黃質(zhì)(indicaxanthin)、3-methoxytyramine-betaxanthin、苯丙氨酸—甜菜黃素[(S)-phenylalanine-betaxanthin]和亮氨酸—甜菜黃素[(S)-leucine-betaxanthin]。

2.2 甜菜紅色素的鑒定

BCs在ESI+模式下容易發(fā)生中性丟失，有脫羧([-44]+)、脫己糖基([-162]+)、脫丙二?；?[-86]+)、脫羧兼脫2個氫([-46]+)等，產(chǎn)生的二級碎片離子中，重要的共有特征離子為m/z551([betanin+H]+)、507([betanin+H-CO2]+)、389([betanidin+H]+)或([betanin+H-Glu]+)、345([betanidin+H-CO2]+)，m/z551,389,345,507可以作為推斷BCs組分的依據(jù)[8,10,20-22]。

表1 火龍果果實甜菜苷類色素的UPLC QTOF-MS/MS鑒定結(jié)果?

續(xù)表1

圖1 丙二酰甜菜苷MS2譜圖

2.3 甜菜黃色素的鑒定

BXs與BCs結(jié)構(gòu)的基本單元是甜菜醛氨酸(betalamic acid)，二者的離子化模式較為相似，BXs在ESI+模式下同樣容易發(fā)生中性丟失，常見的有脫羧([-44]+)、脫羧兼脫1個氫([-45]+)、脫羧兼脫2個氫([-46]+)、脫2個羧基([-88]+)、脫2個羧基兼2個氫([-90]+)、脫羥基([-17]+)、脫亞甲基([-14]+)、脫甲基([-15]+)等[8,10,20-22]。

圖2 丙二酰甜菜苷裂解途徑

圖3 梨果仙人掌黃質(zhì)MS2譜圖

2.4 甜菜苷類色素在不同類型果實與部位的分布特征

由圖5可知，3種類型火龍果果實中，RR果實中BLs種類最豐富，共鑒定了18種組分(15種BCs和3種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、莧菜紅苷、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷、脫羧新甜菜苷、千日紅苷-III、6'-O-malonyl-2-descarboxylated-betanin、hylocerenin、2-de-carboxylated hylocerenin、2'-(5''-O-E-feruloylapiosyl) betanin、bougainvillein-R-I、梨果仙人掌黃質(zhì)、3-methoxytyramine-betaxanthin和苯丙氨酸—甜菜黃素；其次是RW果實，鑒定了9種組分(8種BCs和1種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、千日紅苷-III、2-decarboxylated hylocerenin和3-methoxytyramine-betaxanthin；YW果實中未發(fā)現(xiàn)BCs，僅鑒定了1種BXs組分，為亮氨酸—甜菜黃素。

RR果實的果皮(RR-P)部位鑒定了BLs組分14種(13種BCs和1種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷、脫羧新甜菜苷、千日紅苷-III、6'-O-mal-onyl-2-descarboxylated-betanin、hylocerenin、2-decarboxy-lated hylocerenin、2'-(5''-O-E-feruloylapiosyl) betanin、bougainvillein-R-I和3-methoxytyramine-betaxanthin；果肉(RR-F)部位11種(9種BCs和3種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、莧菜紅苷、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、新丙二酰甜菜苷、脫羧新甜菜苷、梨果仙人掌黃質(zhì)、3-methoxytyramine-betaxanthin和苯丙氨酸—甜菜黃素。RW果實的果皮(RW-P)部位鑒定了BLs組分 9種(8種BCs和1種BXs)，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷、脫羧丙二酰甜菜苷、apiosyl-betanin、2'-O-apiosylphyllocactin、千日紅苷-III、2-decarboxylated hylocerenin和3-methoxytyramine-betaxanthin；果肉(RW-F)部位未檢測到BLs組分。YW果實的果皮(YW-P)、果肉(YW-F)部位均未檢測到BCs，僅各檢測到BXs組分1種，均為亮氨酸—甜菜黃素。

圖4 梨果仙人掌黃質(zhì)裂解途徑

圖5 甜菜苷類色素在不同類型果實與部位的分布

綜上，紅皮紅肉型和紅皮白肉型火龍果中BLs種類豐富，黃皮白肉型則較少；其次，BLs主要分布在紅色果肉和紅色果皮部位，在白色果肉和黃色果皮部位分布較少。RR與RW為紅皮型火龍果，二者含有共有BLs組分，例如甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷和脫羧丙二酰甜菜苷等，但是3種類型火龍果之間未發(fā)現(xiàn)共有BLs組分。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，紅皮紅肉型、紅皮白肉型和黃皮白肉型3種類型火龍果果實中共鑒定了甜菜苷類色素組分19種，其中甜菜紅色素組分15種，甜菜黃色素組分4種。紅皮紅肉型和紅皮白肉型火龍果中含有共有組分，包括甜菜苷、甜菜苷配基、丙二酰甜菜苷和脫羧丙二酰甜菜苷等。甜菜苷類色素在不同類型果實及部位的分布存在差異，不同類型果實甜菜苷類色素種類豐富程度由高至低依次為紅皮紅肉型>紅皮白肉型>黃皮白肉型，不同部位則為：紅皮紅肉型果皮>紅皮紅肉型果肉>紅皮白肉型果皮>紅皮白肉型果肉、黃皮白肉型果皮>黃皮白肉型果肉。研究表明，甜菜苷類色素具有廣泛的生物活性，而且色澤鮮艷，既是理想的功能性食品成分，又是良好的天然植物源著色劑，在食品、藥品、化妝品和寵物食品等行業(yè)應用前景廣泛，尤其適于添加到素食人群食品中，將來可對甜菜苷類色素的制備與應用進行深入研究，實現(xiàn)火龍果尤其是果皮部位的高值化利用。