陳少先 - 劉 悅 曾瑤英 - 余 倩

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品學(xué)院，廣東 廣州 510225)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個(gè)亞種，是革蘭氏陽(yáng)性好氧細(xì)菌，菌體成桿狀，內(nèi)生孢子，在自然界中廣泛分布[1]。近年來(lái)，貝萊斯芽孢桿菌主要作為生防菌在報(bào)道，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究大多集中在促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、抑菌物質(zhì)及其基因簇鑒定、拮抗作用機(jī)制等方面[2-5]，在抑制病原菌和生物防治方面具有顯著優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室在腐敗的鷹嘴桃中分離并鑒定出一株貝萊斯芽孢桿菌，將其命名為貝萊斯芽孢桿菌zk1(Bacillusvelezensiszk1)，該菌對(duì)鷹嘴桃的致腐能力極強(qiáng)，而關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌作為腐敗菌的報(bào)道極少。

果蔬的腐爛通常是由病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶[6]通過(guò)對(duì)細(xì)胞壁間多糖物質(zhì)降解，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使果實(shí)軟化，引起致腐。宋喜霞[7]判斷果膠甲基反式消除酶和多聚半乳糖醛酸酶在銹腐菌侵染人參過(guò)程中起了重要作用；李寶聚等[8]證明果膠酶、纖維素酶在黃瓜黑星病菌致病中起著重要作用，是主要的致病因子之一；也有文獻(xiàn)[9]報(bào)道灰葡萄孢菌株的致病力與β-葡聚糖苷酶具有相關(guān)性；李喜玲[10]證明了灰葡萄孢菌株的致病力與纖維素酶活力呈正相關(guān)，灰霉菌果膠酶活力高低與致病力強(qiáng)弱有一定的相關(guān)性。以上研究都表明了腐敗菌分泌的酶類是侵染宿主的關(guān)鍵致病因子，此外，病原菌在侵入宿主初期會(huì)遇到細(xì)胞壁屏障，病原菌釋放細(xì)胞壁降解酶，從而有利于其入侵，也為其他微生物的入侵提供便利，加速寄主的腐敗。

國(guó)內(nèi)外對(duì)核果果實(shí)采后病害的病理生理和采后病害控制技術(shù)方面已經(jīng)做了大量的研究[11-12]，但對(duì)降解細(xì)胞壁酶類的酶學(xué)性質(zhì)研究較少，且在關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌對(duì)水果的致腐作用目前尚未報(bào)道。研究擬檢測(cè)菌株Bacillusvelezensiszk1致病后導(dǎo)致鷹嘴桃成分和果肉超微結(jié)構(gòu)的變化，有針對(duì)性地開(kāi)展其中相關(guān)酶的酶學(xué)特性研究，以期得到該菌株中與植物致病相關(guān)酶的最適反應(yīng)溫度、pH值和金屬離子信息，為進(jìn)一步解釋其致病的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌zk1(Bacillusvelezensiszk1，zk1)：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；

鷹嘴桃：廣東省河源市連平縣三角湖果園；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)和營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)：青島海博生物技術(shù)有限公司；

木聚糖：分析純，美國(guó)Sigma試劑公司；

無(wú)水葡萄糖、半乳糖醛、D-木糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

生化培養(yǎng)箱：SPX-150型，上海悅豐儀器儀表有限公司；

立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋：LX-C35L型，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：H2500R-2型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

凍干機(jī)：HX-18型，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-IF型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

電熱恒溫干燥箱：DHG-942D0A型，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備 貝萊斯芽孢桿菌zk1先用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基復(fù)活，再用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液在37 ℃、120 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，傳代兩次，比濁法調(diào)整菌數(shù)為104CFU/mL。

1.3.2 鷹嘴桃的成分檢測(cè)

(1) 樣品前處理：挑選同一批次的健康鷹嘴桃，采用菌液刺傷接種法，在赤道部位接種6個(gè)點(diǎn)/果，常溫保濕(RH≥85%)培養(yǎng)48 h。用無(wú)菌刀具削取每果赤道部位組織(帶果皮)，修切成10 mm×10 mm×10 mm的小方塊，冷凍干燥72 h，打粉(2 800 r/min，5 min)，過(guò)60目篩備用。以注射無(wú)菌蒸餾水的鷹嘴桃為對(duì)照組。

(2) 成分檢測(cè)：淀粉含量按GB 5009.9—2016的酸水解法執(zhí)行；纖維素、半纖維素和果膠含量按NY/T 3165—2017的濾紙袋法執(zhí)行。

1.3.3 貝萊斯芽孢桿菌zk1致病鷹嘴桃的透射電鏡(TEM)觀察 用菌液刺傷感染的方式，將菌株zk1接種到健康的鷹嘴桃，噴無(wú)菌蒸餾水保濕，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后在超凈工作臺(tái)切取病健交接部位的組織，用刀片修整為1 mm×1 mm×3 mm的樣品塊，整個(gè)取樣過(guò)程不超過(guò)2 min，即刻放入含2.5%戊二醛的磷酸—檸檬酸緩沖液溶液(pH 7.4)固定24 h。對(duì)照組用無(wú)菌蒸餾水接種健康鷹嘴桃果實(shí)并在同樣條件下培養(yǎng)，參照病果的取樣部位，切取對(duì)照組的桃果肉組織樣品。

按照常規(guī)TEM樣品制備方法[13]略作改動(dòng)。1%四氧化鋨將待測(cè)樣品塊固定6 h，含2.5%戊二醛的磷酸—檸檬酸、酸緩沖液溶液(pH 7.4)漂洗2 h，用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇浸泡10 min進(jìn)行梯度脫水，氧化丙稀和丙稀環(huán)氧樹(shù)脂稀釋液浸透，Epon812包埋；超薄切片機(jī)定位并切成70～100 nm超薄切片。然后用檸檬酸鉛和醋酸鈾電子染色，最后用透射電鏡觀察。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 淀粉酶活測(cè)定采用YOO改良法[14]；果膠酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]；纖維素酶活力測(cè)定按GB/T 23881—2009執(zhí)行；木聚糖酶活力測(cè)定按GB/T 23874—2009執(zhí)行。以每分鐘降解底物釋放1 μmol葡萄糖(或D-半乳糖醛酸、木糖)所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

根據(jù)以上方法制作標(biāo)曲。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=12.46x+0.248 4，R2=0.996 7；半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=1.463x+0.072 9，R2=0.997 4；木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=1.579x+0.067 8，R2=0.998 3。

1.3.5 粗酶液制備及酶活力測(cè)定 吸取1 mL菌懸液加入100 mL含有1.00 g淀粉的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，誘導(dǎo)菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)酶。5 000 r/min離心20 min后得到的上清液即為淀粉酶粗酶液。4 ℃保存?zhèn)溆?，?8 h內(nèi)使用。將淀粉分別替換成羧甲基纖維素鈉、果膠、木聚糖，制得纖維素酶粗酶液、果膠酶粗酶液、木聚糖酶粗酶液。

試驗(yàn)前先將待測(cè)粗酶液、底物溶液(1.0 g/100 mL)于37 ℃預(yù)熱10 min。在25 mL具塞比色管中依次加入1 mL 底物溶液、1 mL檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液、0.5 mL 粗酶液和1.5 mL去離子水，振蕩3～5 s。于40 ℃ 水浴鍋水浴30 min，再加入2 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min，立刻用水冷卻至室溫，加水定容至25 mL。在540 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。每個(gè)試樣進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，保留3位有效數(shù)字。淀粉酶活性的測(cè)定底物為1%淀粉溶液，纖維素酶活性的測(cè)定底物為1%羧甲基纖維素鈉溶液，果膠酶活性的測(cè)定底物為1%果膠溶液，木聚糖酶活性的測(cè)定底物為1%木聚糖溶液。

空白測(cè)定：粗酶液沸水浴滅活5 min，其余步驟同上，吸光值記為A0。

淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶酶活性按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

X——粗酶液的酶活力，U/mL；

A1——粗酶液反應(yīng)的吸光值；

A0——空白樣反應(yīng)的吸光值；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

C0——標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；

t——酶解反應(yīng)時(shí)間，min；

M——摩爾質(zhì)量。

1.3.6 貝萊斯芽孢桿菌zk1酶學(xué)性質(zhì)研究

(1) 酶促反應(yīng)最適溫度：在pH 5.0的條件下，將粗酶液與檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液混合，分別以30，40，50，60，70，80，90 ℃為反應(yīng)溫度，反應(yīng)30 min，測(cè)定相應(yīng)的酶活力。每處理做3個(gè)平行，取平均值計(jì)算酶活數(shù)值，最高酶活力值記為100%，計(jì)算出各溫度下的酶活力。

(2) 酶促反應(yīng)最適pH值：在最適溫度條件下，將粗酶液分別與用pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的緩沖劑調(diào)配的底物混合，作用30 min，測(cè)定相應(yīng)的酶活力，每處理做3個(gè)平行，取平均值計(jì)算酶活數(shù)值，以酶活力最高值為100%，計(jì)算各個(gè)pH條件下的酶活力。

(3) 金屬離子對(duì)酶活性的影響：參照崔海洋等[16]的方法并略作修改，在最適溫度和pH條件下，在粗酶液中分別加入0.15 mmol/L金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+)化合物、氯化物及硫酸鹽，測(cè)定相應(yīng)的酶活力，每處理做3個(gè)平行，取平均值計(jì)算酶活數(shù)值，以未添加金屬離子的粗酶液酶活數(shù)值為100%，計(jì)算各金屬離子下的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴桃成分檢測(cè)

在植物體內(nèi)，質(zhì)體中包含的淀粉粒是多糖的主要貯藏形式，先前有研究[17]發(fā)現(xiàn)桃果肉細(xì)胞中淀粉粒還存在于細(xì)胞間隙。而果膠會(huì)與半纖維素、纖維素形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，起到維持細(xì)胞骨架形態(tài)的作用[18]。由圖1可知，鷹嘴桃被菌株zk1侵染后，果實(shí)中的淀粉、纖維素、半纖維素和果膠含量都出現(xiàn)了一定程度的減少，推測(cè)菌株zk1具備較強(qiáng)的糖苷水解和多糖裂解能力。以鷹嘴桃果肉為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源時(shí)，該菌在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸產(chǎn)生相關(guān)酶類，用來(lái)消耗培養(yǎng)環(huán)境中的淀粉、纖維素、半纖維素和果膠等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)其附著在鷹嘴桃等水果表面，與之接觸的部位就成為了營(yíng)養(yǎng)供給體，接觸部位的果肉組織隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗而逐漸坍塌腐爛，最終果肉大面積腐敗。

2.2 貝萊斯芽孢桿菌zk1致病鷹嘴桃的掃描電鏡觀察結(jié)果

如圖2(a)所示，鷹嘴桃接種無(wú)菌水培養(yǎng)24 h后，果肉組織結(jié)構(gòu)未受到破壞，果肉細(xì)胞完整，排列整齊。細(xì)胞之間有小間隙，大液泡占據(jù)細(xì)胞內(nèi)部的主要面積，其余細(xì)胞器被液泡擠到邊緣，豐富的細(xì)胞內(nèi)含物緊靠細(xì)胞壁分布。果肉細(xì)胞壁緊密，細(xì)胞壁之間的中膠層是高密度的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁與中膠層在透射電鏡下成像明暗分明，可清楚辨別。液泡膜將液泡和其他細(xì)胞內(nèi)含物隔開(kāi)，靠近細(xì)胞壁的細(xì)胞內(nèi)含物中包括了葉綠體、線粒體、質(zhì)體和淀粉顆粒。所有細(xì)胞內(nèi)含物均保持了正常的形態(tài)。葉綠體為兩端較尖長(zhǎng)條形細(xì)胞器，長(zhǎng)度約1 μm。線粒體是圓形的細(xì)胞器，可以看到其內(nèi)有突起嵴。

如圖2(b)所示，鷹嘴桃果肉被菌株zk1侵染后，果肉組織則遭到了嚴(yán)重的損壞。細(xì)胞壁致密性降低，部分結(jié)構(gòu)降解導(dǎo)致細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞壁與中膠層之間的明暗對(duì)比度淡化。中膠層溶解并與細(xì)胞壁剝離，細(xì)胞間隙加大，細(xì)胞壁出現(xiàn)漂移。部分細(xì)胞壁彎曲，細(xì)胞內(nèi)含物進(jìn)入細(xì)胞壁，相鄰的細(xì)胞之間的聚合度明顯下降。細(xì)胞器已出現(xiàn)降解，細(xì)胞壁空腔化，葉綠體與線粒體發(fā)生變形，大部分線粒體破裂，葉綠體片層結(jié)構(gòu)不清晰。液泡膜消失，液泡與質(zhì)體互溶。大淀粉顆粒被分解成零散小顆粒。

圖1 鷹嘴桃成分檢測(cè)結(jié)果

從圖2可以看出，細(xì)菌zk1對(duì)鷹嘴桃的細(xì)胞有極強(qiáng)的破壞能力，可以在短短的24 h內(nèi)將健康的鷹嘴桃果肉組織瓦解。病變果肉細(xì)胞具體表現(xiàn)為細(xì)胞壁、中膠層、淀粉顆粒等細(xì)胞內(nèi)含物和結(jié)構(gòu)組織的損壞。細(xì)胞壁中存在木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖等聚多糖[19]30-33，果膠和纖維素分別是中膠層和微纖絲的主要成分[20-21]，結(jié)合鷹嘴桃被侵染前后的成分檢測(cè)，推測(cè)細(xì)菌zk1應(yīng)該具有分解這些成分的能力。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酶促反應(yīng)最適溫度 如圖3所示，菌株zk1能針對(duì)不同的外源誘導(dǎo)物產(chǎn)生相應(yīng)的酶(粗酶液)，且這些酶對(duì)溫度的適應(yīng)能力不同。木聚糖酶在40 ℃下的相對(duì)酶活數(shù)值為0.036 1 U/mL。果膠酶的最適溫度為50 ℃，達(dá)到0.102 U/mL。反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，纖維素酶和淀粉酶的相對(duì)酶活力最優(yōu)，分別為0.831 0，0.336 2 U/mL。由此可見(jiàn)，此菌株在較高的反應(yīng)溫度條件下，纖維素酶和淀粉酶依然存活。半纖維素是植物細(xì)胞壁中廣泛存在的雜聚多糖，而木聚糖是半纖維素的主要組成部分[19]9。將菌株zk1接種鷹嘴桃后，主要是在37 ℃培養(yǎng)，接近試驗(yàn)中的40 ℃。根據(jù)酶促反應(yīng)最適溫度的結(jié)果，該菌株對(duì)鷹嘴桃的致病作用可能是依賴于木聚糖酶對(duì)桃果細(xì)胞壁中木聚糖的水解功能，從而破壞了桃果細(xì)胞壁的半纖維素結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是，在40 ℃下，淀粉酶依然保持了較好的酶解能力，酶活力有0.694 6 U/mL。而此溫度下，纖維素酶的活力為0.294 6 U/mL，與一株擁有高效纖維素酶基因的枯草芽孢桿菌工程菌的酶活力檢測(cè)數(shù)值接近[22]。

CW. 細(xì)胞壁 CC. 細(xì)胞內(nèi)含物 V. 液泡 ICS. 細(xì)胞間隙 P. 質(zhì)體 M. 線粒體 Chl. 葉綠體 ML. 中膠層 S. 淀粉粒 T. 液泡膜

圖3 溫度對(duì)酶活性的影響

2.3.2 酶促反應(yīng)最適pH值 如圖4所示，與最適溫度結(jié)果(圖3)類似的是，果膠酶對(duì)反應(yīng)條件的變化最敏感。隨著外部反應(yīng)條件因素的改變，果膠酶活力的變化幅度最大。與果膠酶的最適pH值一樣，纖維素酶的最適pH值亦為6。在最適pH值下，纖維素酶活力為0.248 3 U/mL，而果膠酶的活力為0.150 6 U/mL。淀粉酶在中性反應(yīng)條件(pH 7)下有最高酶活力，達(dá)到0.458 7 U/mL。木聚糖酶則表現(xiàn)出偏向堿性條件(pH 8)的耐受能力，這與一些菌株的木聚糖酶學(xué)特性研究結(jié)果不同。孫超[23]研究發(fā)現(xiàn)，桔青霉的木聚糖酶最適pH為5.5。其中的原因除了菌株之間存在物種基因差異，還可能是因?yàn)檠芯康木陑k1分泌的木聚糖酶具有獨(dú)特的酶結(jié)構(gòu)。

2.3.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 如圖5所示，除了Mn2+外，其余金屬離子能促進(jìn)淀粉酶的酶活力。同時(shí)，Mn2+也是纖維素酶的抑制劑。由此推測(cè)，菌株zk1所分泌的淀粉酶和纖維素酶具有相似的結(jié)構(gòu)，Mn2+能通過(guò)與氨基酸分子—SH基結(jié)合，使酶分子失活或變性[24]。但對(duì)于果膠酶而言，Mn2+則是一種激活劑，可令其相對(duì)酶活力超過(guò)114%。這可能是因?yàn)榻饘匐x子與酶分子氨基酸側(cè)鏈的氧原子相結(jié)合，通過(guò)穩(wěn)定的鍵作用力增強(qiáng)了酶活性區(qū)域的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，或者形成了酶與底物的復(fù)合體[25]。試驗(yàn)中，不同的金屬離子并未對(duì)木聚糖酶的酶活力造成負(fù)面影響，但林小洪等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+和Cu2+對(duì)木聚糖酶具有明顯的抑制作用；楊穎等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+對(duì)來(lái)源于AT24的木聚糖酶具有激活作用，而對(duì)來(lái)源于AT22-2的木聚糖酶卻具有抑制作用，這可能與不同木聚糖酶的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，具體機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究論證。

圖4 pH值對(duì)酶活性的影響

同一種酶的小寫(xiě)字母不同表示鄧肯(D)法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著

3 結(jié)論

貝萊斯芽孢桿菌zk1侵染鷹嘴桃后，鷹嘴桃果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)變形、細(xì)胞器破裂、溶解等現(xiàn)象。推測(cè)該菌通過(guò)分泌淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶來(lái)降解鷹嘴桃的果皮的纖維素和果肉中的淀粉、果膠等，從而使鷹嘴桃腐爛。酶學(xué)特性研究的結(jié)果顯示該菌分泌的淀粉酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH值是7，0.15 mmol/L 的Mn2+可抑制淀粉酶的活力；纖維素酶最適溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH值是6，Mn2+也可對(duì)其起抑制作用；木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH值是8，多種金屬離子均是激活劑；果膠酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH值是6，Mn2+對(duì)其激活效果最優(yōu)。試驗(yàn)探究了貝萊斯芽孢桿菌zk1對(duì)鷹嘴桃的致病機(jī)理及其酶學(xué)性質(zhì)，但未具體掌握該菌株降解植物細(xì)胞壁時(shí)各種多糖水解酶的結(jié)構(gòu)，之后的研究方向可以考慮在這些方面繼續(xù)挖掘。