張壯壯，閆魯霞，程蓓蓓，朱長軍

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387；3.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

有絲分裂是真核細(xì)胞生長分裂的基本方式，染色體的形成和分離是保證有絲分裂過程中細(xì)胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵.定位于染色體上的多種蛋白質(zhì)能夠?qū)θ旧w的形成和分離進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)還有許多其他因素參與，共同形成一個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，最終保證遺傳物質(zhì)以極高的保真度分配到子細(xì)胞中[1-2].有絲分裂期間，遺傳物質(zhì)染色質(zhì)被壓縮凝集成染色體，這涉及一系列蛋白分子的精密調(diào)控，如拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，TopoⅡ）會(huì)輔助染色體凝集復(fù)合物（condensin complexes）生成染色體內(nèi)部連接[3].部分驅(qū)動(dòng)蛋白也會(huì)參與到染色質(zhì)凝集過程中[4]，如定位到染色體的驅(qū)動(dòng)蛋白KIF4A，因其具有結(jié)合染色體的特性，故也被稱為染色體驅(qū)動(dòng)蛋白.

驅(qū)動(dòng)蛋白是一類能依賴自身ATP酶活性沿著微管在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的蛋白分子[5-6].KIF4A屬于驅(qū)動(dòng)蛋白4家族的一員[7]，具有多種功能，包括參與神經(jīng)細(xì)胞的自發(fā)性收縮[8]、DNA損傷修復(fù)反應(yīng)[9]、在減數(shù)分裂中調(diào)控著絲粒與微管的結(jié)合[10]以及在有絲分裂中調(diào)控染色體的凝集與整列[11].KIF4A的異常表達(dá)往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、患者的不良預(yù)后有關(guān)，例如KIF4A在大部分肺癌中高表達(dá)[12]，卻在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中低表達(dá)[13].且KIF4A的DNA修復(fù)功能與非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥性有關(guān)[14].KIF4A由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N末端馬達(dá)結(jié)構(gòu)域（motor domain）、中央螺旋卷曲桿狀結(jié)構(gòu)域（coiled-coil stalk）、C末端貨物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（tail region）[15].KIF4A的染色體定位受眾多因素的影響，但這些因素的先后順序與主導(dǎo)因素并不清楚.KIF4A的尾部結(jié)構(gòu)域?qū)τ贙IF4A的染色體定位發(fā)揮了重要作用，現(xiàn)研究證明，KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域上存在許多影響其染色體定位的位點(diǎn)，如T1161、S1186、L1214[16-18]等.除此之外，KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域上還含有半胱氨酸富集區(qū)[19]（cysteinerich motif，CR），具有的半胱氨酸的特性會(huì)使其形成含有二硫鍵的鋅指結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別并結(jié)合DNA[20].但KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域的CR區(qū)調(diào)控KIF4A識(shí)別結(jié)合不同結(jié)構(gòu)DNA的分子作用機(jī)制仍不明確.

為了探究體外KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA的特性，本研究將含有CR區(qū)的KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域分別與具有線性雙螺旋結(jié)構(gòu)和超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒共孵育.選擇pBluescript-SK（-）質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有質(zhì)量小、電泳條帶變化明顯的特點(diǎn)，且質(zhì)量不會(huì)過小，避免了相同物質(zhì)的量的條件下因熒光強(qiáng)度過小不利于觀察的情況.應(yīng)用檢測(cè)分析體外蛋白-DNA結(jié)合的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），對(duì)KIF4A尾部與DNA的相互作用進(jìn)行深入探究.

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

pET-21a（+）質(zhì)粒、pBluescript-SK（-）質(zhì)粒、pEGFPKIF4A-WT質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)室自存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans T1，北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌BL21（CE3）感受態(tài)細(xì)胞，北京索萊寶科技有限公司.

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Kpn I、EcoR I、Sal I、Xho I，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；Blue Plus VProtein Marker（10×103～190×103）、ProteinIso Ni-NTRResin，北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶、Super DNA Marker、凝膠回收試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，凱杰生物科技有限公司；EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5×）、EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍(lán)色，10×），碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.3 方法

1.3.1 pET-KIF4A-C278誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)編碼KIF4A的第954～1 232位氨基酸的基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物（上游引物：5′-CGGAATTCCTTTTCCTTGTCG-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAGTGGGCCTC-3′）.以pEGFP-KIF4A-WT質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，得到兩端帶有EcoR I與Sal I酶切位點(diǎn)的KIF4A-C278的基因序列.用EcoR I酶和Sal I酶進(jìn)行酶切（37℃水浴，20 h）.將pET-21a（+）質(zhì)粒用相同的酶進(jìn)行酶切，用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物.用T4 DNA連接酶將KIF4A-C278序列連接到pET-21a（+）質(zhì)粒上，得到的產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化到Trans T1感受態(tài)細(xì)胞中.用含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克?。?7℃，過夜培養(yǎng)），所得的單克隆在含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培（37℃，225～250 r/min，過夜培養(yǎng)）.收集過夜培養(yǎng)的菌體進(jìn)行少量質(zhì)粒提取，用雙酶切進(jìn)行鑒定.鑒定正確的質(zhì)粒送到天津金唯智生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中的KIF4A序列進(jìn)行比對(duì).

1.3.2 截短突變體KIF4A-C278蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的pET-KIF4A-C278質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，用氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基篩選陽性克?。?7℃，過夜培養(yǎng)）.挑取單克隆，用氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)（37℃，225～250 r/min，過夜培養(yǎng)），菌液于4℃保存.取少量菌液再次用含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)培（37℃，225～250 r/min，2 h），取少量菌液制成誘導(dǎo)表達(dá)前的樣品，剩余菌液加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)質(zhì)粒表達(dá)（37℃，225～250 r/min，2 h），取少量菌液制成誘導(dǎo)表達(dá)后的樣品.將上述樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，用甲醇/冰乙酸脫色.觀察誘導(dǎo)后菌體是否有目的蛋白表達(dá).

1.3.3 KIF4A-C278蛋白的純化

取上述用IPTG誘導(dǎo)成功的誘導(dǎo)前菌液，加入到50 mL含有1 mmol/L的IPTG的LB氨芐抗性液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)（37℃，225～250 r/min，2 h）.收集誘導(dǎo)后的菌液，4℃、8 000 r/min條件下離心5 min，收集細(xì)菌沉淀，用2 mL裂解液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH值為8.0）和溶菌酶（終質(zhì)量濃度為10 mg/mL）冰上裂解細(xì)菌沉淀30 min，并用超聲波充分裂解.4℃、1 000 r/min條件下離心30 min，收集上清，加入0.5 mL的Ni-NTRResin，4℃混勻60 min.用洗液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH值為8.0）洗Ni-NTR Resin，最后用洗脫液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH值為8.0）將蛋白洗脫下來.上述操作過程均留樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測(cè)蛋白表達(dá)與純化情況.將最終純化的蛋白條帶與1μg BSA樣品條帶進(jìn)行灰度值比較，估算蛋白濃度.純化的蛋白分裝好后用液氮速凍，-80℃條件下保存.

1.3.4 KIF4A-C278蛋白與DNA結(jié)合凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）

選取本課題組自存質(zhì)粒pBluescript-SK（-），該質(zhì)粒是用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取并自存，有較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大小約2 960 bp.將質(zhì)粒與純化蛋白以一定的物質(zhì)的量之比混在一起，在EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液中于室溫（20～25℃）孵育40 min.加入EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液制樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并成像觀察質(zhì)粒的滯后情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-KIF4A-C278質(zhì)粒構(gòu)建

KIF4A的結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示，插入目的片段KIF4AC278為954～1 232 bp的KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域.對(duì)得到的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1（b）所示.無論是單酶切還是雙酶切，條帶大小均正確.酶切鑒定及測(cè)序序列比對(duì)顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功.

圖1 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證Fig.1 Detection of recombinant plasmid

2.2 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將相同細(xì)胞量的未誘導(dǎo)菌液與IPTG誘導(dǎo)后的菌液制成樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳.用考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇/冰乙酸脫色液脫色后觀察，所得結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，IPTG誘導(dǎo)后樣品在低于40×103條帶處有大量目的蛋白表達(dá).證明IPTG誘導(dǎo)成功，且目的蛋白分子質(zhì)量正確.

圖2 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)KIF4A-C278蛋白Fig.2 IPTG induces the expression of KIF4A-C278 protein

2.3 KIF4A-C278蛋白純化結(jié)果

收集50 mL的IPTG誘導(dǎo)后菌液，高速離心后收集菌體沉淀并用裂解液裂解.裂解液高速離心后收集上清，將上清用Ni-NTR Resin濃縮純化.用洗液洗Ni-NTR Resin，可以看到洗液中不含目的蛋白.用洗脫液將目的蛋白從Ni-NTR Resin上洗脫下來，可以看到第4次洗脫液中的目的蛋白較為純凈，幾乎沒有雜帶，且含量較高，如圖3所示.根據(jù)條帶的灰度值估測(cè)，KIF4A-C278的質(zhì)量濃度約為0.1μg/μL.

圖3 KIF4A-C278蛋白純化結(jié)果Fig.3 Purification results of Protein KIF4A-C278

2.4 蛋白-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了探究KIF4A-C278蛋白結(jié)合DNA的功能，將蛋白與DNA在體外環(huán)境下孵育，觀察其結(jié)合情況.選取分子質(zhì)量偏小的pBluescript-SK（-）質(zhì)粒，將KIF4A-C278蛋白與質(zhì)粒DNA在室溫下（20～25℃）孵育40 min.預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，質(zhì)粒與蛋白物質(zhì)的量之比為1∶1 000時(shí)結(jié)果較清晰，結(jié)果如圖4（a）所示.相比于對(duì)照組，加入KIF4A-C278蛋白的實(shí)驗(yàn)組在大于3 000 bp處發(fā)現(xiàn)了較為明顯的滯后條帶.用Image J進(jìn)行條帶的灰度值分析，用GraphPad Prism8進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖，結(jié)果如圖4（b）表示，加入KIF4A-C278純化蛋白后的滯后條帶與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.

圖4 蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig.4 Protein-DNA binding assay

2.5 酶切對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了探究質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)對(duì)KIF4A-C278結(jié)合DNA的影響，將質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Kpn I酶切1 h.酶切后的質(zhì)粒為線性雙螺旋DNA，與之前未酶切的超螺旋結(jié)構(gòu)DNA形成對(duì)照.此次實(shí)驗(yàn)組為酶切后質(zhì)粒與KIF4A-C278純化蛋白共孵育，對(duì)照組采取了酶切后質(zhì)粒與無蛋白空白對(duì)照組、酶切后質(zhì)粒與無蛋白洗脫液對(duì)照組、酶切后質(zhì)粒與BSA陰性對(duì)照組.除此之外，還加入了前面實(shí)驗(yàn)中的未酶切質(zhì)?？瞻讓?duì)照組.結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出，質(zhì)粒大小正確（位置低于3 000 bp的條帶），且酶切過的線性質(zhì)粒DNA不能與KIF4A-C278蛋白結(jié)合，未形成滯后條帶.

圖5 蛋白質(zhì)-線性DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig.5 Protein-linear DNA binding assay

3 討論與結(jié)論

染色體驅(qū)動(dòng)蛋白分子KIF4A在細(xì)胞中具有多個(gè)功能，如在DNA復(fù)制時(shí)穩(wěn)定基因組、在胞質(zhì)中運(yùn)送物質(zhì)等[21]，其中最主要也是目前最受關(guān)注的是KIF4A在有絲分裂尤其是早期的功能.KIF4A在染色體上發(fā)揮功能是基于其染色體定位的，此過程受眾多因素調(diào)節(jié)，如染色體凝集素（condensin I）的CAP-G亞基與KIF4A尾部上的Leu1214位點(diǎn)相結(jié)合[22]、Aurora A激酶磷酸化調(diào)控KIF4A與condensinⅠ的相互作用[23]、Cdk1激酶磷酸化KIF4A尾部的Thr1161位點(diǎn)與Ser1186位點(diǎn)等，這些位點(diǎn)都會(huì)影響KIF4A的染色體定位.由此可見，KIF4A的尾部結(jié)構(gòu)對(duì)其染色體定位至關(guān)重要.但目前并未分析出這些因素中的相互關(guān)系與主導(dǎo)因素.現(xiàn)有研究皆為細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)暫為空缺.在有絲分裂前期，condensin I定位在核膜上時(shí)，KIF4A在核中是如何定位到染色體上的，是否依靠自身的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域尚未明確.為了探究KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域能否自主結(jié)合DNA以及該過程的影響因素，本研究純化了KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域蛋白，通過用線性雙螺旋、超螺旋2種結(jié)構(gòu)的DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)行共同孵育，發(fā)現(xiàn)KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域會(huì)與超螺旋DNA結(jié)合并產(chǎn)生滯后條帶，卻不結(jié)合線性雙螺旋DNA.即KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域有著自身結(jié)合DNA的能力，但并不會(huì)時(shí)刻表現(xiàn)出來.由于此KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域蛋白本身含有結(jié)合DNA功能的CR區(qū)域以及T1161、S1186、FF1220等調(diào)控KIF4A染色體定位的位點(diǎn)，因此推測(cè)，KIF4A尾部結(jié)構(gòu)域可能受到某些位點(diǎn)的影響.且KIF4A在細(xì)胞內(nèi)是以二聚體形式行使功能，而構(gòu)建的蛋白有一小段螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域，在體外也有可能會(huì)形成二聚體形式.這一結(jié)果可能會(huì)對(duì)KIF4A結(jié)合DNA產(chǎn)生影響.基于此可以提出一個(gè)模型：KIF4A依靠其尾部結(jié)構(gòu)中的CR結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合DNA，其他的位點(diǎn)會(huì)對(duì)此過程有調(diào)控作用.這預(yù)示著KIF4A在有絲分裂開始染色質(zhì)凝縮形成染色體時(shí)，可能會(huì)依賴于此功能識(shí)別并趨向于定位在染色體上.