張露露，卞云迪，張 馳，劉曉穎，范寶莉，王振英

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

由禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminisf.sp.tritici（Bgt））引起的小麥白粉病常發(fā)生于多雨、潮濕地區(qū)，病菌多侵染小麥的葉片、葉鞘等部位，影響小麥生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)13%～34%[1].小麥?zhǔn)艿讲≡w侵害后，會(huì)立即啟動(dòng)抗病基因進(jìn)行防御反應(yīng).在流行病害初期，植物抗病基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性可以有效減緩病害的發(fā)展進(jìn)程，隨著病原菌最適生長(zhǎng)溫度、濕度等環(huán)境條件的改變，病原菌增殖受到抑制，最終避免病害發(fā)生.因此，分析小麥在白粉菌侵染早期的基因表達(dá)模式對(duì)于探究小麥抗病機(jī)理具有重要意義.

Brock是一個(gè)強(qiáng)抗白粉病小麥品種，李根橋等[2]研究發(fā)現(xiàn)，該品種攜帶Pm2基因.Pm2是位于小麥5DS染色體上的一個(gè)編碼NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗病蛋白基因[3].本課題組前期分別在抗病親本Brock、感病親本京411及其抗病近等基因系BJ-1中擴(kuò)增Pm2基因的cDNA序列，最終只在Brock中擴(kuò)增到該基因cDNA序列，而京411和BJ-1中沒有擴(kuò)增到該基因，因此推測(cè)抗病近等基因系BJ-1中的抗性不是來自Pm2，Brock作為BJ-1的抗源供體，至少還含有一個(gè)Pm2以外的抗病基因[4].Carver等[5]利用白粉菌孢子侵染大麥時(shí)發(fā)現(xiàn)，侵染20 s內(nèi)就可檢測(cè)到白粉菌孢子所釋放的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）.Klement等[6]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌能夠在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)煙草細(xì)胞發(fā)生超敏反應(yīng).Both等[7]發(fā)現(xiàn)，小麥白粉菌病原體侵染30 min到5 d內(nèi)小麥中會(huì)出現(xiàn)一些與初級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的酶.這些結(jié)果均表明，病原菌與宿主細(xì)胞的互作發(fā)生在接種后的1 h內(nèi).本課題組前期的研究工作中，比較了抗病品種Brock、感病品種京411以及它們的抗病近等基因系BJ-1在白粉菌脅迫下的早期應(yīng)答模式，發(fā)現(xiàn)抗病品種Brock和抗病近等基因系BJ-1均在2 hpi（hours post inoculation）對(duì)白粉菌做出應(yīng)答反應(yīng)[8-9]，說明小麥在白粉菌侵染早期就已開始啟動(dòng)防御反應(yīng).在小麥與病原菌互作應(yīng)答的研究中，雖已鑒定出許多差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），但對(duì)于早期防御應(yīng)答中的差異表達(dá)基因以及由這些基因構(gòu)建的不同抗病信號(hào)途徑還需要進(jìn)一步探究.

本研究利用高通量RNA-seq技術(shù)鑒定了白粉菌脅迫下抗病品種小麥Brock中2～8 hpi的差異表達(dá)基因，并分析了抗病相關(guān)基因的表達(dá)模式.這將為深入探究白粉菌侵染早期的小麥抗白粉病模式提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

抗白粉病小麥品種Brock，英國(guó)引進(jìn).白粉菌生理小種E09，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供.

實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品的制備及文庫構(gòu)建

待小麥生長(zhǎng)至一心一葉期接種白粉菌E09.分別在0、2、4和8 hpi，剪下相同部位的小麥葉片，分別提取葉片總RNA.提取步驟按照植物RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司）說明書進(jìn)行.將2、4和8 hpi的小麥葉片總RNA樣品等量混合作為實(shí)驗(yàn)組文庫（BMI），以0 hpi的葉片總RNA作為對(duì)照組文庫（BCI），2組樣品處理各設(shè)置2個(gè)重復(fù)，共4個(gè)文庫.RNA-seq文庫的構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組分析工作由諾禾致源生物技術(shù)有限公司完成.所有RNA-seq數(shù)據(jù)已上傳至NIH Short Read Archive數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），登錄號(hào)為PRJNA480377.

1.2.2 數(shù)據(jù)處理和差異表達(dá)分析

從Ensembl（ftp：//ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-35/fasta/triticum_aestivum/dna/）下載小麥參考基因組信息.使用DESeq R軟件（1.18.0）對(duì)2個(gè)處理（每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)生物學(xué)重復(fù)）進(jìn)行差異表達(dá)分析，并設(shè)置經(jīng)校正后的P值＜0.05時(shí)為差異表達(dá)基因.

1.2.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

利用GOseq R package（1.18.0）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（gene ontology）分類，并對(duì)基因長(zhǎng)度偏差進(jìn)行校正.利用KOBAS software在KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg/）中對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析.GO和KEGG富集分析中，經(jīng)校正后的P值＜0.05時(shí)被認(rèn)為顯著富集.

1.2.4 qRT-PCR驗(yàn)證

Brock幼苗長(zhǎng)至一葉一心期時(shí)，按照1.2.1方法接種白粉菌并分別對(duì)0、2、4和8 hpi的葉片進(jìn)行取材.按照1.2.1中的方法制備小麥RNA，并利用M-MLV Reverse Transcriptase（美國(guó)Promega公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)根據(jù)cDNA非保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物，如表1所示.根據(jù)Fast Start Universal SYBR Green Master mix（美國(guó)Roche公司）說明配制PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10μL，cDNA 1μL，F(xiàn) 1μL，R 1μL，ddH2O 7μL.利用ABI 7500型定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：50℃2 min；95℃10 min，95℃15 s，58℃30 s，40個(gè)循環(huán).反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析，以確定引物的特異性.每個(gè)qRT-PCR測(cè)定設(shè)置3個(gè)重復(fù).使用小麥Actin基因作為內(nèi)參基因，并通過2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉菌脅迫下Brock小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，小麥BMI組的平均clean reads數(shù)據(jù)量為61.61 M，BCI組的平均clean reads數(shù)據(jù)量為57.50 M.Q20（%）均大于96%，且只存在＜1%的錯(cuò)誤，說明測(cè)序結(jié)果良好，如表2所示.將獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與小麥參考基因組序列（Ensembl Genomes release-35）進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示每個(gè)文庫中約有91%的reads都能與參考基因組比對(duì)，且與參考基因組有唯一比對(duì)位置的reads大約為86%.以上結(jié)果證明測(cè)序數(shù)據(jù)可信，可用于后續(xù)分析.統(tǒng)計(jì)FPKM＞1的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，構(gòu)建維恩圖和火山圖分析兩組之間的差異基因，結(jié)果如圖1所示.BCI組樣品中，F(xiàn)PKM＞1的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為45 195，BMI組為47 963.此外，從BCI和BMI樣品中檢測(cè)到unigenes分別為3 064條和5 832條.以P＜0.05、|log2（fold change）|＞|1|為條件進(jìn)行DEGs的篩選分析，BMI vs.BCI共有4 625個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 511個(gè)被上調(diào)，3 114個(gè)被下調(diào)，如圖1（b）所示.

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary for the transcriptome sequencing and assembly

圖1 差異表達(dá)基因韋恩圖和火山圖Fig.1 Venn diagram and volcano map of differentially expressed genes

2.2 差異表達(dá)基因的功能注釋

為了探究白粉菌脅迫下小麥中的抗病基因表達(dá)模式，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG通路分析，富集結(jié)果如表3和圖2中所示.在BMI與BCI的比較中，上調(diào)轉(zhuǎn)錄本主要富集在亞麻油酸代謝、α-亞麻酸代謝和玉米素生物合成途徑，而下調(diào)轉(zhuǎn)錄本中顯著富集苯丙氨酸代謝、脂肪酸鏈伸長(zhǎng)和植物-病原體互作通路.另外，在一組熱圖分析中顯示了白粉菌脅迫下主要參與基因的表達(dá)水平，例如植物-病原體互作通路和植物激素信號(hào)途徑等，如圖2所示.

表3 KEGG富集分析Tab.3 Statistical enrichment analysis for KEGG pathways

圖2 差異表達(dá)基因熱圖分析Fig.2 Heatmaps analysis of a group of differentially expressed genes

根據(jù)KEGG和熱圖分析結(jié)果，利用qRT-PCR檢測(cè)不同通路中的9個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)模式：來自植物-病原體互作途徑中的4個(gè)DEGs，分別為PR1（pathogenesis-related proteins 1）、WRKY33（WRKYtranscription factor33）、RPM1（resistance to pseudomonas syringae pv.maculicola 1）和RIN4（RPM1 interacting protein 4）；1個(gè)參與黃酮和黃酮醇的生物合成途徑的基因FOM1（flavone O-methyltransferase l）；1個(gè)參與脂肪酸的生物合成和伸長(zhǎng)基因LCACS4（long chain acyl CoA synthetase 4）；2個(gè)參與植物激素信號(hào)的傳導(dǎo)基因NPR1和NPR2（nonexpressor of pathogenesis-related gene 1 and 2）；1個(gè)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABCC10（ABC transporter family C10）.接種白粉菌后，WRKY33、RPM1、RIN4、FOM1、LCACS4、NPR1和NPR2共7種DEGs的表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的降低，只有PR1和ABCC10的表達(dá)水平被上調(diào)，如圖3所示.

圖3 差異表達(dá)基因的表達(dá)模式分析Fig.3 Analysis of expression patterns of differentially expressed genes

2.3 RPM1和RIN4的表達(dá)模式分析

本研究中，病程相關(guān)蛋白PR1在2 hpi上調(diào)表達(dá)，為本底表達(dá)的8倍，說明由病原微生物觸發(fā)的免疫反應(yīng)已經(jīng)開始；而抗病基因RPM1在初期2～8 hpi內(nèi)表達(dá)下調(diào)，且與之互作的RIN4表達(dá)在2～4 hpi下調(diào)，到8 hpi恢復(fù)到本底表達(dá)水平.為了進(jìn)一步分析RPM1和RIN4在小麥抗白粉病應(yīng)答反應(yīng)初期的關(guān)聯(lián)，對(duì)抗病小麥Brock中RPM1和RIN4在0～72 hpi的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RPM1的相對(duì)表達(dá)量在2 hpi降低，在12 hpi增加，在24 hpi達(dá)到最大，如圖4（a）所示，即為本底表達(dá)的2.3倍，隨后略有下降，到72 hpi時(shí)仍高于本底表達(dá)，約為1.8倍.而RIN4表達(dá)量雖然在24 hpi時(shí)略有升高，在2 hpi也略有降低，但總體趨勢(shì)變化不明顯，均徘徊在本底水平，如圖4（b）所示.

圖4 白粉菌侵染0～72 h RPM1和RIN4的表達(dá)模式分析Fig.4 Expression of RPM1 and RIN4 under powdery mildew stress at 0-72 hours post inoculation

3 討論與結(jié)論

3.1 早期抗病防御應(yīng)答在植物抵御病原菌侵染中發(fā)揮重要作用

小麥白粉病是由布氏白粉菌侵染引起的真菌病害.白粉菌孢子接觸到介質(zhì)后，20 s內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），有助于白粉菌孢子附著到介質(zhì)表面，激發(fā)植物表面防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)工作[5，7].ECM發(fā)揮作用的時(shí)間為12 hpi左右，之后ECM便降解.在8 hpi后，小麥葉片表面會(huì)有附著胞形成，15 hpi后，附著胞下開始形成侵入釘，在表皮細(xì)胞形成初生吸器[7].因此，8～15 hpi應(yīng)該是白粉菌成功侵染小麥的關(guān)鍵階段.在本課題組早期研究中克隆得到了一個(gè)早期應(yīng)答基因TaCOI1，并發(fā)現(xiàn)在2 hpi時(shí)該基因即在抗性小麥品種Brock中開始表達(dá)，且在抗病小麥中的基因應(yīng)答速率明顯快于感病材料[8-9].由此說明小麥在病原菌侵染早期就已開始應(yīng)答，故而探究植物與病原菌互作的早期應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)對(duì)了解小麥抗病機(jī)理具有重要意義.本研究對(duì)抗白粉病小麥品種Brock的早期應(yīng)答基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共鑒定出4 625個(gè)差異表達(dá)基因，分屬小麥與白粉菌互作應(yīng)答的20條主要途徑.在已經(jīng)公布的中國(guó)春小麥基因組序列中，Pm2基因的同源序列編號(hào)為TraesCS5D01G044600.1（TRIAE_CS42_5DS_TGACv1_457363_AA1485540.1）.對(duì)本研究鑒定出的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白粉菌侵染早期，TraesCS5-D01G044600.1的表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化.因此認(rèn)為在白粉菌侵染早期（8 hpi以內(nèi)），Brock中Pm2基因?qū)Π追劬秩緫?yīng)答不明顯.Brock可能通過其他的抗病基因或抗病反應(yīng)通路發(fā)揮作用.

通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了來自不同途徑的9種DEGs的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在8 hpi之前，大部分基因表達(dá)下調(diào)，只有編碼病原菌與小麥互作蛋白的PR1和ABCC10基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào).說明來自不同途徑的多個(gè)基因均參與小麥與病原菌的早期互作反應(yīng)，但病原菌侵染早期大多數(shù)基因首先被抑制表達(dá).

3.2 早期抗病應(yīng)答中的PTI和ETI響應(yīng)時(shí)間

植物在遭受病原菌侵害時(shí)，為了保證自身的正常生長(zhǎng)發(fā)育，逐漸進(jìn)化出一套有序的分子調(diào)控機(jī)制[10].第一類是類受體激酶或類受體蛋白識(shí)別受體（RPPs）識(shí)別微生物/病原菌相關(guān)的分子模式（MAMPs/PAMPs）觸發(fā)的免疫反應(yīng)（MTI/PTI）[11-12].PR1基因是PTI反應(yīng)過程的一個(gè)標(biāo)志性基因，PR1表達(dá)上調(diào)，意味著PTI被激活[13].為了進(jìn)一步抵御親和性病原菌，植物逐漸進(jìn)化出第二層防御屏障，稱為效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI）[14].植物ETI過程主要依賴于抗?。≧）基因產(chǎn)物，如RPM1[15]、MLA[16]等NBS-LRR類[17]基因.有報(bào)道RIN4作為植物基礎(chǔ)防御的調(diào)節(jié)劑，既可以調(diào)控PR1表達(dá)，也可以通過AvrRpm1和AvrB激活RPM1介導(dǎo)的植物抗性[18].

本研究發(fā)現(xiàn)在接種白粉菌2 hpi后，PR1的表達(dá)量平均增加了8倍，說明由病原微生物觸發(fā)的免疫反應(yīng)在2 hpi就做出應(yīng)答.抗病基因RPM1在接種白粉菌初期表達(dá)下調(diào)，12 hpi才開始增加，此后一直維持高水平表達(dá).Wu等[19]在研究由Lr47介導(dǎo)的小麥抗葉銹病基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)，TaPR1（GenBank NO.FJ815169.1）和TaRPM1（RPM1-AA1836940）基因的表達(dá)高峰分別發(fā)生在48 hpi和72 hpi.雖然總體趨勢(shì)相似，但本研究發(fā)現(xiàn)PR1和RPM1基因?qū)Π追劬秩镜捻憫?yīng)時(shí)間更早，分別為2 hpi和12 hpi，而RPM1的互作基因RIN4的表達(dá)量在0～72 hpi雖有變化，但不顯著，進(jìn)一步說明RIN4作為“衛(wèi)兵分子”，并不直接參與抗病反應(yīng)，而是通過病原菌分泌蛋白，調(diào)節(jié)RPM1產(chǎn)生抗性[18，20].綜上，在小麥抗白粉病防御反應(yīng)初期，PTI早在2 hpi就被觸發(fā)，ETI在12 hpi也開始響應(yīng)，植物PTI和ETI協(xié)同作用抵抗白粉菌早期侵染.本研究結(jié)果為揭示小麥-白粉菌早期互作機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù).