戴佳煒，施賽健，宋璦蔚，王志斌，莊春林，夏春年 （. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 004；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004；. 上海蒙特沃德學(xué)院）

癌癥對(duì)人類是僅次于心血管疾病的第二大“殺手”，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。相關(guān)統(tǒng)計(jì)表明，2018 年，全球新增癌癥病例1 810 萬(wàn)，死亡病例960 萬(wàn)[2-3]。預(yù)計(jì)到2030 年，新增癌癥病例和死亡人數(shù)將增長(zhǎng)約1.5 倍，其防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻[4]。目前，治療惡性腫瘤的方法主要有手術(shù)切除、放射療法、生物治療以及藥物治療等[5]。其中，藥物治療仍是腫瘤治療的重要手段。但一半以上的癌癥對(duì)傳統(tǒng)化療藥物已產(chǎn)生明顯耐藥。臨床證據(jù)顯示，90%以上轉(zhuǎn)移性癌癥患者死于不同程度的耐藥[6]，腫瘤耐藥已成為目前臨床化療失敗的首要原因。因此，開發(fā)多藥耐藥的新型抗腫瘤化療藥物已迫在眉睫。

微管蛋白抑制劑一直是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一[7]。微管是由α/β 微管蛋白組成的異二聚體，是細(xì)胞骨架的主要組成部分[8]。微管具有多種生物學(xué)功能，能參與細(xì)胞增殖、分裂等一系列過(guò)程[9-13]，在細(xì)胞生命周期中起重要作用，是腫瘤細(xì)胞中的重要治療靶標(biāo)。紫杉醇、長(zhǎng)春堿等微管蛋白抑制劑已廣泛用于治療多種癌癥。然而，它們顯示出治療窗窄、選擇性差以及多藥耐藥性問(wèn)題，通常是由于P 糖蛋白[14]或微管相關(guān)蛋白的過(guò)表達(dá)引起的[15]。因此，選擇性好的低毒小分子靶向微管蛋白抑制劑仍有很大需求。

查爾酮衍生物是類黃酮中一類重要的化合物，分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，以1,3-二苯基丙烯酮為基本骨架，具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、抗菌等[16-19]。吲哚查爾酮是本課題組研究發(fā)現(xiàn)的一類新型查爾酮衍生物，相比經(jīng)典的查爾酮，其抗腫瘤活性顯著提高，作用機(jī)制研究表明該類化合物作用于β 微管蛋白上的秋水仙堿位點(diǎn)[20]，規(guī)避了P 糖蛋白調(diào)控的腫瘤多藥耐藥機(jī)制[21]以及β-Ⅲ型微管蛋白過(guò)表達(dá)的影響[22]，具有良好的抗腫瘤耐藥活性?；衔颋C58 是本課題組前期合成的查爾酮類衍生物之一，具有非常好的抗腫瘤活性（A549，GI50= 38 nmol/L）[23]。課題組以此化合物為研究對(duì)象，考察其對(duì)多種白血病細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制活性，特別是耐藥白血病細(xì)胞的活性，并通過(guò)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)分析其作用特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

全自動(dòng)酶標(biāo)儀（BioTek，型號(hào)：Synergy 2）；流式細(xì)胞儀（BD，型號(hào)：Accuri C6）；熔點(diǎn)測(cè)試儀（上海精科，型號(hào)：WRR）；核磁共振儀（Bruker，型號(hào)：Ascend 400)；高分辨質(zhì)譜儀（Waters，型號(hào)：UPLC G2-XS QTOF）；薄層色譜硅膠板（煙臺(tái)江友，型號(hào)：HSGF254）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純（伊諾凱）。紫杉醇、長(zhǎng)春堿、多柔比星（Sigma-Aldrich），純度>98%。HL60、HL60/DOX、 K562、 K562/HHT300、 CCRF-CEM、CCRF-CEM/VLB100 由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室傳代和凍存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 (E)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮的合成[24]

將1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙-1-酮(1, 0.21 g,1.0 mmol)與1H-吲哚-3-甲醛(2, 0.07 g, 0.5 mmol)溶于乙醇(4 ml)溶液中，加入哌啶(0.11 ml, 1.2 mmol)，加熱至95 ℃攪拌48 h，然后加入鹽酸調(diào)節(jié)pH = 6淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，飽和碳酸氫鈉溶液、水和飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾、旋干有機(jī)相，剩余粗品經(jīng)乙醇在?20 ℃重結(jié)晶，得到目標(biāo)化合物FC58 0.017g，重結(jié)晶產(chǎn)率：10%，黃色固體，熔點(diǎn)：175.1～176.8 ℃，路線見(jiàn)圖1。1H NMR (400MHz, CDCl3)δ: 8.71 (1H, br, NH), 8.13(1H, d,J= 15.6 Hz, =CH), 8.00 (1H, m, Ar-H), 7.63(1H, s, Ar-H), 7.55 (1H, d,J= 15.2 Hz, =CH), 7.46(1H, m, Ar-H), 7.31 (4H, m, Ar-H), 3.96 (9H, s,3×OCH3)。13C NMR (100MHz, CDCl3)δ: 189.86,153.10, 138.78, 137.23, 134.44, 130.08, 123.57,120.54, 117.82, 114.52, 111.99, 105.96, 60.97,56.40。ESI-MS (m/z) : C20H19NO4[M+H]+，理論值：338.138 7, 實(shí)際值：338.138 5。

圖1 FC58 的合成路線

2.2 體外抗腫瘤活性測(cè)試[23]

樣品配制：用適量DMSO（Sigma，C6295）溶解后，配成50 mmol/L 的母液備用。取一定量的母液，用完全培養(yǎng)基將其稀釋成一定濃度的溶液，作為初濃度。將初濃度溶液用完全培養(yǎng)基3 倍稀釋，共設(shè)置6 個(gè)濃度梯度。

CellTiter-Blue 法測(cè)試體外抗腫瘤活性。具體方法簡(jiǎn)述如下：96 孔板每孔加入濃度為(2～4)×104個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液200 μl，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h 后，加入配制好的一定濃度梯度的待測(cè)物溶液，每孔200 μl，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入200 μl 的含1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)48 h。每孔加入含10%CellTiter-Blue（Promega，G8081）的完全培養(yǎng)基，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)530/40 nm 和590/35 nm 處的熒光值(FV)作為背景值。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)1～4 h，再用酶標(biāo)儀在相同條件下讀取熒光值。

細(xì)胞存活率（%）= 給藥孔ΔFV/空白對(duì)照孔ΔFV。

根據(jù)各個(gè)濃度的細(xì)胞存活率值，使用GraphPad Prism 5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合可得到量效曲線和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)50%的藥物濃度，即GI50。

根據(jù)藥物對(duì)非耐藥母代細(xì)胞和對(duì)耐藥細(xì)胞的GI50計(jì)算藥物的耐藥指數(shù)(DRI)。公式: DRI =GI50(耐藥細(xì)胞)/GI50(母代細(xì)胞)。

2.3 細(xì)胞周期試驗(yàn)[23]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HL60 和HL60/DOX 細(xì)胞，用胰酶消化分散成單細(xì)胞懸液，以（5×105個(gè)/孔）接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的待測(cè)藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清液，用0.25% Trypsin-EDTA（Gibco，25 200 056）消化，1 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞。用1 ml 預(yù)冷的PBS（Hyclone，SH30256.FS）潤(rùn)洗細(xì)胞1 次，離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用9 ml 預(yù)冷的70%乙醇輕輕混勻，4 ℃固定過(guò)夜。次日，離心沉淀細(xì)胞后，棄固定液，用1 ml 預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，再次離心收集細(xì)胞。加入1 ml PI（50 μg/ml PI, 0.1 mg/ml RNase A, 0.05 % TritonX-100，碧云天）染液染色，4 ℃下避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，用EXPO32 ADC 軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 體外抗腫瘤活性研究

課題組選擇多種白血病細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞(HL60、HL60/DOX、K562、K562/HHT300、CCRFCEM、CCRF-CEM/VLB100)對(duì)紫杉醇、長(zhǎng)春堿、多比柔星以及查爾酮衍生物FC58 進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試。結(jié)果如表1 所示，紫杉醇、長(zhǎng)春堿和多柔比星對(duì)HL60、K562、CCRF-CEM 細(xì)胞均有較強(qiáng)活性，GI50在0.12～135.30 nmol/L。而各耐藥細(xì)胞對(duì)上述3 種藥物明顯耐藥，GI50在17.16～1 398 nmol/L。耐藥指數(shù)DRI 在3.85～684.4。與紫杉醇、長(zhǎng)春堿、多柔比星相比，雖然查爾酮衍生物FC58 對(duì)以上白血病細(xì)胞的活性相對(duì)較弱，GI50在30.23～44.20 nmol/L，但對(duì)耐藥白血病細(xì)胞具有優(yōu)異活性，GI50在17.56～51.77 nmol/L，較親代細(xì)胞更為敏感（圖2）。DRI 分別是0.40、0.90、1.71。其中，CCRFCEM/VLB100 細(xì)胞對(duì)FC58 僅輕微耐藥(DRI=1.71)，遠(yuǎn)低于其他幾種化療藥。

圖2 FC58 對(duì)耐藥和非耐藥白血病細(xì)胞的GI50 值

3.2 細(xì)胞周期分析

微管蛋白抑制劑可干擾微管蛋白-微管之間的平衡，阻斷有絲分裂M 期紡錘體的形成，導(dǎo)致有絲分裂停滯于G2/M 期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)FC58、多柔比星、紫杉醇和長(zhǎng)春堿對(duì)HL60 和HL60/DOX 細(xì)胞周期的影響，考察其作用機(jī)制。

如圖3 所示，與空白組相比，經(jīng)1.3 倍IC50FC58 處理的組，停滯在G2/M 期的細(xì)胞明顯增多。其作用強(qiáng)于紫杉醇，弱于長(zhǎng)春堿。經(jīng)多柔比星處理的組，停滯在S 期和G2/M 期的細(xì)胞較空白組有一定程度的增多。FC58、紫杉醇和長(zhǎng)春堿的耐藥細(xì)胞組的結(jié)果與非耐藥細(xì)胞組結(jié)果基本相同。經(jīng)FC58 處理的組，停滯在G2/M 期的細(xì)胞明顯增多，且作用強(qiáng)于其余藥物。多柔比星使細(xì)胞周期停滯在S 期的耐藥細(xì)胞明顯增多。上述結(jié)果提示，F(xiàn)C58 的作用靶點(diǎn)為微管蛋白。同時(shí)，F(xiàn)C58 對(duì)細(xì)胞周期的影響結(jié)果與長(zhǎng)春堿較相似，間接證明了FC58 和長(zhǎng)春堿作用機(jī)制相似。這可能是FC58 對(duì)CCRF-CEM/VLB100 細(xì)胞輕微耐藥的原因。

圖3 FC58、多柔比星、紫杉醇和長(zhǎng)春堿作用24 h 后對(duì)HL60 和HL60/DOX 細(xì)胞周期的影響

4 結(jié)論

吲哚查爾酮類衍生物FC58 對(duì)多種白血病細(xì)胞均有較強(qiáng)活性，GI50達(dá)納摩爾級(jí)。對(duì)耐藥的白血病細(xì)胞同樣具有較強(qiáng)的活性，比親代白血病細(xì)胞更為敏感，活性抗耐藥指數(shù)遠(yuǎn)強(qiáng)于紫杉醇、長(zhǎng)春堿和多柔比星。FC58 和其他微管蛋白抑制劑一樣都能使細(xì)胞周期停滯在G2/M 期，間接驗(yàn)證其作用靶點(diǎn)為微管蛋白。FC58 作為一個(gè)潛在的抗耐藥白血病的先導(dǎo)化合物，有必要進(jìn)一步研究其體內(nèi)的抗腫瘤活性。