毛肇潔，林冰潔，余遠(yuǎn)，王霞,2，咸麗，張羽，楊忠欣，張豐香,2

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濰坊 261053）（2.濰坊市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261053）（3.瑞福油脂股份有限公司，山東濰坊 261057）

芝麻在我國(guó)已經(jīng)有兩千多年的栽培史，是重要的油料作物之一，香油源于芝麻，又稱(chēng)為芝麻油、麻油，是中國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味植物油。其中，用水代法加工制取的芝麻香油稱(chēng)為小磨香油，其制油工藝具有操作溫度低、營(yíng)養(yǎng)成分及香味物質(zhì)損失少的優(yōu)點(diǎn)，是中國(guó)傳統(tǒng)的、特有的制油方法，在我國(guó)已有600多年歷史[1]。小磨香油較冷軋香油儲(chǔ)藏穩(wěn)定性高，產(chǎn)品呈琥珀色、香味濃郁、口感綿長(zhǎng)，其營(yíng)養(yǎng)豐富并具有獨(dú)特的風(fēng)味，深受世界各國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)，除在我國(guó)香油市場(chǎng)占主導(dǎo)地位，還遠(yuǎn)銷(xiāo)韓國(guó)、日本、東南亞等，廣受?chē)?guó)際贊譽(yù)。

焙炒是小磨香油的關(guān)鍵工藝，在150~200 ℃高溫條件下，芝麻當(dāng)中會(huì)發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，其中最主要的就是美拉德反應(yīng)，使焙炒后的芝麻香味濃郁，較多研究者認(rèn)為是芝麻中含有的還原糖和氨基酸在焙炒過(guò)程中生成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[2]，經(jīng)水代法提取香油后剩余的芝麻渣呈深褐色[3]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中，改變食品色澤的這類(lèi)物質(zhì)被稱(chēng)類(lèi)黑精，是美拉德反應(yīng)后期生成的一類(lèi)褐色的大分子含氮化合物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)黑精不僅能賦予食物色澤和風(fēng)味，還有很好的生物活性，如抗氧化、抑菌、抗炎、益生元活性等[5]，類(lèi)黑精的結(jié)構(gòu)目前尚未得出定論，但現(xiàn)有的研究表明類(lèi)黑精的主要是由重復(fù)單元的吡咯或呋喃組成的聚合物。小磨香油加工剩余的芝麻渣仍然具有很高的營(yíng)養(yǎng)成分，若未能及時(shí)處理，當(dāng)作廢料丟棄或者只是用來(lái)做肥料，則對(duì)資源造成了浪費(fèi)[6]。目前絕大部分芝麻渣僅是簡(jiǎn)單的作為飼料處理，對(duì)其中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的研究不足，影響芝麻渣深度的開(kāi)發(fā)利用。因此，本研究主要圍繞小磨香油芝麻渣中類(lèi)黑精的提取及活性展開(kāi)，為芝麻渣的深度開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮小磨香油芝麻渣，瑞福油脂股份有限公司；牛血清蛋白、DPPH，Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G250、葡萄糖、PBS、抗壞血酸，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī)（3-16KL），德國(guó)Sigma公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE），昆山市超聲儀器有限公司；臺(tái)式酸度計(jì)（FE28），梅特勒-托利多集團(tuán)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-5100B），上海元析儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Thermo1510），美國(guó)賽默飛世爾科技公司；冷凍干燥機(jī)（FDU-2110），日本EYELA公司；電子舌（SA402B），日本INSENT；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iS50），美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 類(lèi)黑精的提取方法

將芝麻渣進(jìn)行冷凍干燥，用30%~60%沸程的石油醚對(duì)干燥后的芝麻渣進(jìn)行脫脂[7]。準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g脫脂芝麻渣樣品6份，分別加入去離子水，pH 8、pH 10的水溶液，體積分?jǐn)?shù)為30%、60%、90%的乙醇溶液50 mL，100 Hz超聲提取1 h；5000 r/min離心10 min；取上清液，在420 nm下測(cè)其吸光度值[8,9]，吸光值越大表示類(lèi)黑精含量越高；將剩余上清液收集透析，截留分子量為14 ku，時(shí)間24 h，間隔4~6 h換水，透析所得產(chǎn)物冷凍干燥，即得芝麻渣類(lèi)黑精組分，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 類(lèi)黑精組分中蛋白和總糖的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[10]；總糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[11]。

1.3.3 類(lèi)黑精及芝麻渣溶液滋味測(cè)定

將不同溶液提取類(lèi)黑精后離心剩余的芝麻渣中加入電子舌基準(zhǔn)液50 mL，100 Hz超聲提取1 h，過(guò)濾，得到濾液，用于測(cè)定苦味；分別稱(chēng)取60%乙醇和pH 10.0堿提取的類(lèi)黑精0.3 g和0.5 g溶于100 mL基準(zhǔn)液中，過(guò)濾之后利用電子舌對(duì)其苦、澀、咸、鮮、酸五味進(jìn)行測(cè)定。測(cè)量循環(huán)次數(shù)為四次。

1.3.4 類(lèi)黑精抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 清除·OH的能力

分別配置0.1、1、2、5 mg/mL的樣品溶液和Vc溶液，將Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，不加樣品溶液作為空白對(duì)照，參照WANG等[12]的方法。分別吸取200 μL不同濃度的溶液置于1.5 mL的離心管中，然后依次加入150 μL的7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、300 μL 8.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和300 μL 7.5 mmol/L雙氧水溶液，旋渦震蕩混勻后在37 ℃下反應(yīng)45 min，用酶標(biāo)儀在510 nm下測(cè)溶液的吸光度值。按下列公式計(jì)算類(lèi)黑精的羥自由基清除率：

注：OD空為不加樣品的空白對(duì)照吸光度，OD樣為加入樣品溶液的吸光度。

1.3.4.2 還原力的測(cè)定

配置1 mg/mL和5 mg/mL的樣品溶液和Vc溶液，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，參考OYAIZU[13]的方法添加試劑，測(cè)溶液在700 nm處吸光度值。

1.3.4.3 DPPH·清除率的測(cè)定

分別配置0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL的樣品溶液和Vc溶液，參照SHYU等[14]的方法測(cè)定芝麻渣類(lèi)黑精DPPH 自由基清除率。

1.3.5 傅里葉紅外光譜儀測(cè)定類(lèi)黑精結(jié)構(gòu)將冷凍干燥后的類(lèi)黑精樣品與純KBr研細(xì)均勻，置于模具中，用(5~10)×107Pa壓力在油壓機(jī)上壓成透明薄片，采用傅立葉變換紅外光譜儀在4000~400 cm-1波數(shù)范圍測(cè)定吸收光譜。掃描次數(shù)16次，分辨率4 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），利用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較、spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶液對(duì)類(lèi)黑精提取的影響

本實(shí)驗(yàn)采用去離子水、不同pH值的堿溶液和不同濃度的乙醇溶液對(duì)冷凍干燥后的芝麻渣類(lèi)黑精進(jìn)行提取，采用420 nm吸光度值的大小表征類(lèi)黑精溶出量的多少[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。隨著溶液pH值的增加，提取溶液的顏色越深，吸光度值越大，pH 10.0提取類(lèi)黑精的吸光度值為1.86；采用不同濃度乙醇提取時(shí)，吸光度值在60%乙醇濃度時(shí)有最大值1.60，90%乙醇取液的吸光度值最低。因此，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)去離子水提、60%醇提和pH 10.0堿提的芝麻渣類(lèi)黑精展開(kāi)研究，與咖啡中的類(lèi)黑精提取不同，焙烤芝麻中類(lèi)黑精多采用乙醇浸提法提取，如SHYU[15]和YOO[16]等都采用了高濃度的乙醇對(duì)焙烤芝麻中的類(lèi)黑精進(jìn)行了提取，在提取劑中適當(dāng)添加有機(jī)溶劑可以減少蛋白的溶解，提高提取效果[17]。

圖1 不同提取溶液在A(yíng)420 nm吸光度值Fig.1 Absorbance values of different extraction solutions in A420nm

2.2 不同溶液提取類(lèi)黑精組份中蛋白和總糖的含量

類(lèi)黑精是還原性的糖和游離的氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)的末期產(chǎn)物，是一類(lèi)大分子、含氮、帶有負(fù)電荷、呈褐色的聚合物，現(xiàn)在研究認(rèn)為類(lèi)黑精可以分為多聚糖型類(lèi)黑精和蛋白質(zhì)型類(lèi)黑精兩大類(lèi)，如咖啡中的類(lèi)黑精多為多聚糖型，而焙烤食品中的多為蛋白質(zhì)型[18]。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)水提、60%醇提和pH 10.0堿提的類(lèi)黑精組分中的蛋白和總糖含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。pH 10.0堿提組分的蛋白含量最高，達(dá)到47.58%，其次是60%醇提30.40%、水提24.89%，這主要因?yàn)橹ヂ楫?dāng)中的蛋白70%左右為11S球蛋白，易溶于堿溶液而不易溶于水[19]；60%醇提組分的總糖含量最高，為25.18%，水提與pH 10.0堿提組分的多糖含量相差不大。利用spearman相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)不同提取溶液的A420值和蛋白含量進(jìn)行相關(guān)性分析，得到r=0.9333，p=0.0007<0.05，即吸光度值與蛋白含量相關(guān)，蛋白含量越高，溶液顏色越深，吸光度值越大，間接說(shuō)明焙烤芝麻渣中的類(lèi)黑精主要是蛋白質(zhì)結(jié)合型的。

圖2 不同溶液提取類(lèi)黑精組分的蛋白和總糖含量Fig.2 Protein and polysaccharide contents of melanoidins extracted by different solutions

2.3 類(lèi)黑精的滋味及芝麻渣的苦味

采用電子舌對(duì)芝麻渣類(lèi)黑精的苦味（Bitterness）、澀味（Astringency）、鮮味（Umami）、酸味（Sourness）、豐富度（Richness）、苦味回味（Aftertaste-A）、澀味回味（Aftertaste-B）和咸味（Salt）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，芝麻渣類(lèi)黑精最突出的滋味是苦味和鮮味。60%醇提類(lèi)黑精在低的濃度下卻有高的苦味值7.28，pH 10.0堿提類(lèi)黑精的苦味值是6.46，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01。對(duì)原芝麻渣和不同溶液提取類(lèi)黑精之后的芝麻渣的苦味進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)圖4。不同溶液提取類(lèi)黑精之后，芝麻渣的苦味都顯著下降，其中60%乙醇提取之后，剩余芝麻渣的苦味最小，其次是pH 10.0堿提，水提之后芝麻渣苦味的降低最小。因此可以推斷使芝麻渣產(chǎn)生苦味的主要是類(lèi)黑精類(lèi)物質(zhì)，人們對(duì)于苦味往往是拒絕的，因?yàn)榭辔锻徽J(rèn)為與有毒和不能吃的東西有關(guān)，但是有些苦味物質(zhì)可作為特色風(fēng)味或?qū)θ梭w有益，比如咖啡、苦瓜等[9]。

圖3 芝麻渣類(lèi)黑精的滋味分析圖Fig.3 Taste analysis diagram of melanoidins from sesame residue

圖4 原芝麻渣和提取類(lèi)黑精后剩余芝麻渣的苦味Fig.4 Bitterness of sesame residue and residual sesame residue after extraction of melanoidins

2.4 芝麻渣類(lèi)黑精的抗氧化活性

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)黑精具有很好的抗氧化活性。LEE等[20]發(fā)現(xiàn)從焙烤芝麻中分離出的褐色組分對(duì)酶促褐變的抑制效果要好于其他組分。YOO等[16]也發(fā)現(xiàn)富含褐色物質(zhì)的甲醇提取組分有很好的抗氧化活性。JO等[21]從脫脂的焙烤芝麻渣中提取的褐色物質(zhì)能防止火雞胸肉和大腿肉中脂質(zhì)的氧化。焙烤芝麻粕中的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有很好的抗氧化活性，隨著焙烤溫度的升高，芝麻粕的甲醇提取物的褐變指數(shù)顯著增加，其清除DPPH·和抑制Cu2+誘導(dǎo)的人LDL氧化的抗氧化作用也增強(qiáng)[22]。ZHAO等[23,24]利用單糖和游離的氨基酸以及芝麻蛋白水解肽制備MRPs，發(fā)現(xiàn)利用木糖和芝麻蛋白肽生成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可顯著提高冷壓芝麻的氧化穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)從·OH和DPPH·的清除能力以及還原能力三個(gè)方面分析了不同溶液提取的芝麻渣類(lèi)黑精的抗氧化活性。

2.4.1 芝麻渣類(lèi)黑精的·OH清除能力

不同溶液提取類(lèi)黑精的·OH清除能力如圖5所示。類(lèi)黑精·OH清除能力和濃度有關(guān)，隨著濃度增加，其清除能力也增加，但都比同等濃度下的Vc的清除率低（p<0.01），這與彭松林等[25]對(duì)鹵烤鴨中類(lèi)黑精的·OH清除能力的研究結(jié)果相一致；當(dāng)濃度大于1 mg/mL時(shí)，水提和堿提類(lèi)黑精的清除率隨濃度增加提升較快，且水提類(lèi)黑精的清除率要高于堿提和醇提類(lèi)黑精（p<0.01），·OH清除能力有隨著類(lèi)黑精濃度的增高而增強(qiáng)的趨勢(shì)，5 mg/mL水提類(lèi)黑精的清除率是樣品中清除率最高的，其清除率達(dá)到了56.52%；當(dāng)濃度小于2 mg/mL時(shí)，醇提的清除率要高于堿提的（p<0.01），類(lèi)黑精的濃度和提取方式是影響·OH清除率的因素。

圖5 不同溶液提取類(lèi)黑精的·OH清除率Fig.5·OH scavenging rate of melanoidin extracted from different solutions

2.4.2 類(lèi)黑精的還原力

彭松林[25]和趙一夢(mèng)[26]等研究發(fā)現(xiàn)鹵烤鴨和黑蒜中的類(lèi)黑精具有一定的還原能力，但是不強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)不同溶液提取的類(lèi)黑精也具有一定的還原能力，具體結(jié)果見(jiàn)圖6。隨著類(lèi)黑精濃度的增加，其還原能力也增加，但都低于同濃度下Vc的還原能力（p<0.01）。不同濃度下，60%醇提類(lèi)黑精的還原能力要高于水提和pH 10.0堿提的（p<0.05）；5 mg/mL的60%醇提類(lèi)黑精的清除率最高，A700nm為0.22，水提和pH 10.0堿提分別為0.16、0.18，而同樣濃度下Vc的A700nm為1.60。

圖6 不同溶液提取類(lèi)黑精的還原力Fig.6 Reducing ability of melanoidins extracted from different solutions

2.4.3 類(lèi)黑精對(duì)DPPH·的清除能力

芝麻渣類(lèi)黑精對(duì)DPPH·的清除能力如圖7所示。芝麻渣類(lèi)黑精清除DPPH·的能力與濃度有關(guān)，在0.1 mg/mL的濃度下，三種溶液提取的類(lèi)黑精的清除能力都要小于Vc對(duì)照組（p<0.01），在此濃度下清除能力最好的是60%醇提類(lèi)黑精，DPPH·清除率達(dá)到47.20%，水提和pH 10堿提分別為40.46%、29.12%；當(dāng)濃度提升到1 mg/mL時(shí)，三種溶液提取類(lèi)黑精的清除能力都有增加，60%醇提類(lèi)黑精的清除能力與Vc對(duì)照組一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05；當(dāng)類(lèi)黑精濃度進(jìn)一步增加到5 mg/mL時(shí)，水提和60%醇提類(lèi)黑精的清除能力與Vc對(duì)照組一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05；pH 10.0堿提類(lèi)黑精的清除能力在1 mg/mL時(shí)最大，清除率為46.91%，當(dāng)濃度增加到5 mg/mL時(shí)下降為16.99%。綜上分析，一定濃度水平下，水提和醇提類(lèi)黑精具有較強(qiáng)的DPPH·的清除能力，清除率可達(dá)95%，顯著高于王明慧[27]等研究的糯米藕類(lèi)黑精DPPH·的清除能力，其改變類(lèi)黑精的相對(duì)濃度，最強(qiáng)清除率僅達(dá)到53.39%。

圖7 不同溶液提取類(lèi)黑精的DPPH·清除率Fig.7 DPPH free radicals scavenging rate of melanoidins extracted from different solutions

2.5 芝麻渣類(lèi)黑精的結(jié)構(gòu)

目前食品中類(lèi)黑精的完整結(jié)構(gòu)還沒(méi)有被破解。但從無(wú)水模型系統(tǒng)（葡萄糖-谷蛋白加熱到150 ℃ 45 min，葡萄糖-甘氨酸/谷氨酸加熱到125 ℃ 2 h）和食品中獲得的高分子量類(lèi)黑素結(jié)構(gòu)已有相關(guān)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)從模型系統(tǒng)、面包皮、咖啡和番茄醬中提取的黑色素，主要由呋喃組成，并含有羰基化合物、吡咯、吡嗪和吡啶等結(jié)構(gòu)[28]。本實(shí)驗(yàn)提取芝麻渣類(lèi)黑精的傅里葉紅外光譜圖如圖8所示。在3050 cm-1附近的弱吸收峰主要是不飽和碳的C-H伸縮振動(dòng)吸收；在1600 cm-1和1500 cm-1附近有強(qiáng)的吸收峰，主要是由芳環(huán)骨架振動(dòng)引起的；在880~680 cm-1范圍內(nèi)存在很弱吸收帶，表明芳環(huán)的氫被取代，形成共軛體系；在1685~1660 cm-1范圍內(nèi)有尖且強(qiáng)的吸收峰，推斷為存在α或β不飽和酮結(jié)構(gòu)；在3385 cm-1附近寬的吸收峰主要?dú)w于O-H和N-H伸縮震動(dòng)，且在1400 cm-1附近存在C-N伸縮震動(dòng)吸收峰[29]。因此，綜上分析，芝麻渣類(lèi)黑精中也存有芳族胺和呋喃等雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖8 芝麻渣類(lèi)黑精的傅里葉紅外變換光圖譜圖Fig.8 Fourier transform infrared spectrogram of melanoidins from sesame dregs

3 結(jié)論

食品類(lèi)黑精已經(jīng)成為眾研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，但是關(guān)于芝麻渣類(lèi)黑精仍鮮少有涉足。本研究采用不同pH值的堿液和不同濃度的乙醇溶液對(duì)芝麻渣中的類(lèi)黑精進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)用pH 10.0的堿溶液和體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇提取芝麻渣中的類(lèi)黑精含量較高，而醇提溶液的苦味值最大，且對(duì)芝麻渣的脫苦能力最強(qiáng)，芝麻渣類(lèi)黑精的滋味主要是由苦味和鮮味值組成，因此60%的乙醇溶液是芝麻渣類(lèi)黑精的良好提取容劑。用pH 10.0的堿溶液提取的芝麻渣類(lèi)黑精的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)47.58%，60%乙醇提取的多糖含量最高，達(dá)25.18%；且提取液的吸光度值與蛋白含量存在相關(guān)性，推斷芝麻渣類(lèi)黑精主要是蛋白結(jié)合型。經(jīng)紅外光譜顯示，芝麻渣類(lèi)黑精中含有芳族胺和呋喃等結(jié)構(gòu)。本研究揭示了芝麻渣類(lèi)黑精的滋味和一定濃度的乙醇溶液對(duì)芝麻渣類(lèi)黑精具有良好的提取性，并研究發(fā)現(xiàn)芝麻渣類(lèi)黑精具有良好的清除DPPH·的能力，為后續(xù)芝麻渣類(lèi)黑精的研究奠定基礎(chǔ)，利用類(lèi)黑精的抗氧化性、抗菌性和抗血糖等功能研究保健食品，延長(zhǎng)食品貨架期[30,31]，并提高芝麻渣的利用率。