李玉壬，王瑞，王旭捷，陳春鳳，楊慧，羅忠芳，楊曉萍

（華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北武漢 430070）

茶多酚（TP）是茶葉中的一種天然活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、提高膜穩(wěn)定性等活性[1]；同時，TP還能通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的組成、改善腸道微環(huán)境，被廣泛應用于改善腸道健康等方面，成為了代謝綜合征治療的熱點選擇[2]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)TP在人體胃腸環(huán)境中的利用率并不可觀。Henning等[3]發(fā)現(xiàn)TP在生物體內(nèi)經(jīng)過胃腸消化后僅有10.00%的有效成分被吸收；趙超藝[4]等通過研究小鼠胃腸消化過程中TP的變化情況，發(fā)現(xiàn)兒茶素在小腸內(nèi)的損失率高達30.00%。這些現(xiàn)象是由TP在消化過程中的不穩(wěn)定性和腸道的低吸收率導致的[5]。胃酸和蛋白酶等物質(zhì)能促進TP中的沒食子酸酯和沒食子酸降解成酚酸及其甘氨酸結(jié)合物等簡單復合物[6]，降解產(chǎn)物一部分先在胃部被吸收，接著在小腸被少量吸收，剩余部分被結(jié)腸中的微生物分解釋放，最終導致TP的生物利用度大幅度降低[7]。這使得與TP相關的深加工制品在人體消化過程中難以保持活性，無法充分發(fā)揮其原有特性。因此，如何提高胃腸消化后TP的生物利用率，成為TP深加工產(chǎn)品急需解決的問題。

探究模擬消化過程中TP成分含量和活性的變化情況對研究如何提高其在胃腸中的生物利用率極為重要。本研究通過構(gòu)建模擬消化模型，探究TP在不同消化階段的含量和抗氧化活性的變化情況，同時選取具有代表性的腸道細菌作為研究對象，分析模擬消化前后TP對主要腸道細菌生長的影響，為提高TP在胃腸中的生物利用度提供新的試驗依據(jù)，并為進一步開發(fā)體內(nèi)高活性的TP深加工制品提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TP（≥98%），安徽紅星藥業(yè)股份有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC8739；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC4356均購買于廣東省微生物研究所。

胃蛋白酶（Pepsin 1:3000）和福林酚，Biosharp公司；胰酶、粘蛋白、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，BR）和2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯丙噻唑琳-6-磺酸二銨鹽（ABTS，98%），上海源葉生物科技有限公司；脂肪酶（10萬U/g）和2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ，99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豬膽鹽，國藥集團化學試劑有限公司；濃鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

722N型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；IS-RDD3型臺式恒溫振蕩器，美國Crystal公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠；生化培養(yǎng)箱，天津市萊伯特瑞儀器設備有限公司；超凈工作臺，蘇信凈化設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 模擬消化樣品制備

分別按王瑞等[8]的方法配制模擬胃液、模擬十二指腸液和模擬膽汁及構(gòu)建模擬消化模型。模擬胃腸消化過程具體操作如下：取TP 0.040 g置于三角瓶中，加入20 mL現(xiàn)配的人工模擬胃液，于37 ℃恒溫，110 r/min振蕩器中分別進行不同時間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）的模擬胃消化處理；胃消化后，先用0.9 mol/L NaHCO3將模擬胃消化液pH值調(diào)至6.0±0.2，然后加入30 mL模擬腸液（20 mL現(xiàn)配的模擬十二指腸液和10 mL現(xiàn)配的模擬膽汁組成），混合均勻后于37 ℃恒溫，110 r/min振蕩器中再分別進行不同時間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）的模擬腸消化處理。分別取不同消化時間的胃消化液、腸消化液，于冰浴條件下鈍化酶的活性、離心（4500 r/min）10 min，取上清液分別用于測定TP的含量、主要兒茶素組分及其抗氧化活性。

1.3.2 TP含量測定

參考GB/T 8313-2008測定[9]，以沒食子酸為標準品。分別測定不同消化階段的樣品溶液于765 nm處的吸光值，計算求得TP含量，結(jié)果以沒食子酸當量（g GAE/g TP）表示。

1.3.3 高效液相色譜法（HPLC）檢測兒茶素主要組成物質(zhì)

參考GB/T 8313-2008[10]和Wu等[11]采用HPLC法測定兒茶素組分及含量。使用Agilent TC-C18分離柱（0.45 μm），在35 ℃柱溫下通過流動相A（0.1%Formic acid和超純水溶劑）和B相（0.1% Formic acid和Methanol溶劑）進行色譜分離，在278 nm處檢測各組分含量。

1.3.4 抗氧化活性

1.3.4.1 總抗氧化能力

參考Benzie等人[12]的方法，取10.0 mM TPTZ溶液、20.0 mM氯化高鐵溶液、0.3 M醋酸鈉緩沖溶液（pH 3.6）以1:1:10的比例均勻混合，此溶液即為TPTZ反應液。取100 μL待測液，加入37 ℃水浴加熱的TPTZ反應液3 mL，恒溫水浴反應30 min后，在593 nm處的吸光度。以不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mM）的硫酸亞鐵繪制標準曲線，結(jié)果以FeSO4當量摩爾數(shù)（mmol Fe2+/g TP）表示。

1.3.4.2 DPPH·清除能力

參考Blois[13]測定方法，取2.0 mL待測液加入2.0 mL DPPH乙醇溶液，搖勻后置于黑暗中室溫下反應30 min，并在波長517 nm處測定反應液的吸光度（Ax）。按下式計算DPPH·清除率（IDPPH，%）：

式中：A0，空白對照吸光值；Ax，樣品吸光值；Ay，參比液吸光值。

以不同質(zhì)量濃度（3、5、10、15、20 μg/mL）的抗壞血酸繪制標準曲線，結(jié)果以抗壞血酸當量（g VCE/g TP）表示。

1.3.4.3 ABTS+·清除能力

參考Re等[14]和Thaipong等[15]方法，具體操作如下：7.0 mM ABTS水溶液與2.45 mM KPS溶液以1:1體積比例混合均勻，黑暗中靜置16 h以上，得ABTS+·儲備液。用95%乙醇溶液在避光條件下稀釋ABTS+·儲備液，使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.05，即ABTS+·反應液。依次取200 μL待測液，加入3.0 mL ABTS+·反應液混合均勻，室溫于黑暗中反應1.0 h，在734 nm波長處測定其吸光度。按下式計算樣品ATBS+·清除能力（IABTS，%）：

式中：A0，空白對照吸光值；Ax，樣品的吸光值。

以不同質(zhì)量濃度（0、16.0、32.0、48.0、64.0、80.0 μg/mL）的抗壞血酸繪制標準曲線，結(jié)果以抗壞血酸當量（g VCE/g TP）表示。

1.3.5 TP對腸道細菌生長的影響

1.3.5.1 菌種的活化和菌懸浮液的制備

將大腸桿菌接種到斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，活化后的大腸桿菌轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)20 h，制備含菌量為105CFU/mL的菌懸液，備用；將嗜酸乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h，活化后的嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，制備含菌量為108～109CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.5.2 大腸桿菌抑菌試驗

分別向1.0 mL無菌水、無菌未消化TP溶液、無菌腸液和消化液中加入100 μL大腸桿菌菌液，置于37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)12 h，平板計數(shù)[16]。

1.3.5.3 對嗜酸乳桿菌增殖的影響

分別向1.0 mL無菌水、無菌未消化TP溶液、無菌腸液和消化液中加入100 μL嗜酸乳桿菌菌液，置于37 ℃靜置24 h，平板計數(shù)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬消化對TP含量與主要成分的影響

2.1.1 模擬消化對TP含量的影響

如圖1所示，模擬胃腸消化后，TP含量顯著降低（p＜0.05）。與未消化相比，胃消化后TP含量明顯降低了12%，但消化時間對含量變化無顯著影響（p＞0.05）。腸消化后TP含量大幅度地降低了35.90%～46.10%，且在0.5～1.5 h之間含量存在顯著性差異（p＜0.05），1.5 h后含量變化趨于穩(wěn)定。比較發(fā)現(xiàn)，TP在腸消化后損失量是胃部的3.60～4.20倍，說明相較于腸部環(huán)境，TP在胃部環(huán)境中更加穩(wěn)定。這與Tenore等[18]研究結(jié)果一致。造成這種差異的原因可能是TP在腸道的弱堿性環(huán)境下會發(fā)生氧化、聚合、降解等反應，導致其含量降低；同時，溶液中的氧氣也會促進上述反應的發(fā)生，使得TP的損失率進一步的提高[19]。

圖1 模擬消化對TP含量的影響Fig.1 Effect of simulated digestion on the content of tea polyphenols

2.1.2 模擬消化對兒茶素主要成分的影響

兒茶素是TP的主要成分，約占TP總量的65.00%～80.00%，主要包括EGCG、ECG、EGC、EC、GC、GCG、C等[20]。由表1可知，模擬消化后兒茶素各組分均發(fā)生顯著變化。兒茶素總量降低了86.40%～91.80%；胃消化后，兒茶素類含量降低了19.90%，其中GCG降低幅度最大，為32.50%，但EGC增加了13.80%。腸消化后，兒茶素類含量顯著降低了86.40%～91.80%，其中EGCG降低幅度最大，為98.40%～98.70%，而GC顯著增加，為97%～114%，這可能與ECG和EGC在消化中的異構(gòu)化作用有關[19,21]。以上結(jié)果說明胃腸消化對兒茶素穩(wěn)定性具有顯著影響，EGCG和EGC對腸液pH環(huán)境更為敏感，這與Tenore等[18]報道結(jié)果一致。

表1 模擬腸消化前后兒茶素主要成分含量的變化Table 1 Changes on the content of the major components of tea polyphenols before and after simulated gastrointestinal digestion

2.2 模擬消化對TP抗氧化活性的影響

2.2.1 總抗氧化能力

如圖2所示，模擬胃腸消化后，TP的總抗氧化能力（FRAP）顯著降低（p＜0.05）。胃消化后，F(xiàn)RAP顯著降低了17.10%～18.30%；腸消化后顯著降低了40%～45%；隨著模擬消化時間的延長，F(xiàn)RAP逐漸降低；不同時間處理對胃消化TP的FRAP無明顯作用（p＞0.05），但對腸消化有顯著差異（p＜0.05）；通過相關性分析可知，在模擬胃腸消化的不同階段，F(xiàn)RAP隨著TP含量的增加而增加。相對于胃消化階段，腸消化后TP的FRAP大幅度降低（p＜0.05），這可能是pH的影響，由FRAP法的pH環(huán)境可知pH=3.6是測定時的最適條件，與胃消化液的pH相近，但腸消化液的pH偏堿性，會對FRAP的測定產(chǎn)生不利影響[22]。

圖2 模擬消化對TP總抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of simulated digestion on the FRAPs of tea polyphenols

2.2.2 DPPH·清除能力

如圖3所示，模擬胃腸消化后，TP的DPPH·清除能力顯著降低（p＜0.05）。胃消化后，TP的DPPH·清除能力降低了6.40%～7.70%；腸消化后顯著降低了58.30%～64.40%；通過相關性分析可知，在模擬胃腸消化的不同階段，DPPH·清除能力隨著TP含量的增加而增加。此外，經(jīng)過模擬消化后，腸消化階段TP對DPPH·清除能力的降低幅度是胃消化階段的8.37倍，說明相對于胃消化，腸部環(huán)境對TP的DPPH·清除能力的影響更為顯著。

圖3 模擬消化對TP清除DPPH·能力的影響Fig.3 Effects of simulated digestion on the DPPH· scavenging abilities of tea polyphenols

2.2.3 ABTS+·清除能力

如圖4所示，模擬胃腸消化后，TP的ABTS+·清除能力顯著降低（p＜0.05）。胃消化后，ABTS+·清除能力顯著降低了38.60%～39.60%；腸消化后降低了10.80%～18.10%；在胃消化階段，ABTS+·清除能力與TP含量變化趨勢相同，二者呈正相關（R2=0.97），但在腸消化階段，ABTS+·清除能力在1.0 h后開始呈現(xiàn)下降趨勢，與TP含量變化趨勢不同，二者相關性不明顯（R2=0.29）。比較胃腸消化結(jié)果可知，腸消化后ABTS+·清除率的降低幅度遠小于胃消化階段，僅是胃消化的0.46倍。說明多酚類ABTS+·清除率呈現(xiàn)pH依賴性，隨著pH升高，清除能力變強。這與多酚化合物芳香環(huán)酚性羥基在弱堿性pH環(huán)境下去質(zhì)子化有關[23]，在腸液pH環(huán)境中TP的去質(zhì)子化更易發(fā)生，從而增強了TP的ABTS+·清除率。此外，研究結(jié)果還表明胃消化后，TP清除ABTS+·能力的降低幅度是清除DPPH·能力的5.10倍，是FRAP的2.20倍，由此可知胃消化對TP各抗氧化活性的影響不同。

圖4 模擬消化對TP清除ABTS+·能力的影響Fig.4 Effect of simulated digestion on the ABTS+· scavenging abilities of tea polyphenols

2.3 TP模擬消化前后對腸道細菌生長的影響

大腸桿菌是腸道中常見的致病性細菌，其在機體內(nèi)會促使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生胺、氨等有害物質(zhì)，對腸道帶來直接損傷，同時分解產(chǎn)物一部分被吸收，對人體產(chǎn)生不利影響[24]。由表2可知，TP在模擬胃腸消化前后均能明顯抑制大腸桿菌的生長，具有顯著的抑菌活性，并且消化后TP的抑菌效果優(yōu)于消化前。這可能與兒茶素經(jīng)過消化后轉(zhuǎn)化為乳酸Ⅰ型代謝產(chǎn)物和Ⅱ型代謝產(chǎn)物等同樣具有一定抑菌活性的物質(zhì)有關[25]。

表2 模擬腸消化前后TP對腸道細菌生長的影響Table 2 Effect of tea polyphenols on the gut bacteriabefore and after simulated gastrointestinal digestion

嗜酸乳桿菌作為腸道有益菌，在一定范圍內(nèi)可以改善人體腸道微生物菌群的平衡，從而提高機體的健康水平[26]。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)消化前的TP能明顯促進嗜酸乳桿菌的增殖，但在模擬消化后TP對嗜酸乳桿菌的生長沒有促進作用，這可能與腸液pH有關。有研究指出嗜酸乳桿菌的最適生長pH為5.5～6.5，隨著pH值的升高，偏堿性環(huán)境會對嗜酸乳桿菌產(chǎn)生抑制作用，降低其存活率[27]，而模擬腸液呈弱堿性不利于其生長，試驗對照樣（嗜酸乳桿菌在不加TP的腸液中培養(yǎng)）中同樣沒有看到菌落的生長，進一步說明腸液pH是影響其生長的主要因素。

3 結(jié)論

3.1 本文通過體外模擬消化的方法，分析了在此過程中TP的含量、主要成分和抗氧化活性的變化情況，以及對腸道主要細菌生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP經(jīng)過模擬消化后含量顯著降低（p＜0.05）；其中，EGCG、GCG等兒茶素類物質(zhì)含量大幅度降低，而EGC和GC含量相對增加；比較胃腸消化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TP在胃部環(huán)境相對穩(wěn)定，含量降低了12%，而在腸部極易分解，大幅度下降了35.90%～46.10%；模擬胃腸消化顯著降低了TP的FRAP，以及對DPPH·和ABTS+·的清除能力（p＜0.05），且不同消化階段TP的抗氧化能力與含量呈正相關，但腸消化階段的ABTS+·清除能力與TP含量相關性并不明顯；TP對大腸桿菌具有顯著抑菌效果，經(jīng)過模擬消化后抑制作用增強，但消化后的TP對嗜酸乳桿菌的生長不再產(chǎn)生影響，產(chǎn)生這種現(xiàn)象是因為腸道的偏堿性環(huán)境不滿足嗜酸乳桿菌的生長條件。

3.2 在人體胃腸消化過程中，不同pH環(huán)境、消化酶、腸道微生態(tài)以及食品基質(zhì)之間存在互相影響，這些因素的綜合作用會導致TP的含量和生物活性發(fā)生不同的變化。因此，探究人體消化過程對TP含量和活性的影響時，需要綜合考慮胃腸環(huán)境的多樣性，這些問題還有待進一步的研究。