熊 武，白 雪，肖 慧，吳玉娟，趙世情，尋 毅，蘭宏偉，袁 維*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208）

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種來(lái)源于骨髓的血管干細(xì)胞，因其修復(fù)內(nèi)膜及促進(jìn)血管新生的作用而備受關(guān)注。EPCs 能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并產(chǎn)生保護(hù)性的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，參與內(nèi)皮修復(fù)，并通過遷移、歸巢到靶組織及結(jié)合到新生血管中參與血管生成[1]。自體EPCs 有望成為治療缺血性疾病血管重建和血管修復(fù)的新選擇[2]。然而糖尿病狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基，導(dǎo)致組織氧化應(yīng)激?；钚匝醯倪^度產(chǎn)生及氧化應(yīng)激水平提高致EPCs功能受損。目前雖然干細(xì)胞療法已被廣泛研究，但基于干細(xì)胞治療糖尿病的臨床研究卻相對(duì)滯后[3-4]。雖然有大量數(shù)據(jù)表明某些糖尿病藥物可以改善“內(nèi)皮功能障礙”[5]，但關(guān)于糖尿病患者人類內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)據(jù)不多，給自體EPCs 治療帶來(lái)挑戰(zhàn)。因此需要建立一種全新策略來(lái)增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量及功能，為成功使用自體內(nèi)皮祖細(xì)胞治療提供可能。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是中藥當(dāng)歸的主要活性成分，具有調(diào)節(jié)血糖、抗氧化和抗炎等多種藥理活性，可預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥[6]。FA 可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，從而改善內(nèi)皮功能障礙[6-7]。然而FA 對(duì)高糖受損EPCs 功能障礙的修復(fù)作用尚未報(bào)道。故本研究主要探討FA 在體外對(duì)高糖受損EPCs 生物學(xué)功能及對(duì)分泌SOD 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8，CK04）購(gòu)自日本同仁；DMEM（SH30022.01B）、PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰酶（Gibco-15050-057）、胎牛血清（10270-106）購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；EGM ?-2MV 培養(yǎng)基（CC-3162）購(gòu)自美國(guó)Lonza 公司；人淋巴細(xì)胞分離液（P8610）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Dil-Ac-LDL 購(gòu)自上海佰曄生物科技中心；FITC-UEA-1（L-9006）、DAPI溶液（D9542）、Fibronectin（F0635）購(gòu)自Sigma 公司；Anti-CD31 抗體（ab28364）、山羊抗兔 IgG（FITC，ab6717）均購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司；Matrigel 基質(zhì)凝膠購(gòu)自美國(guó)Becton Dickson 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；過超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）購(gòu)自上海融禾公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng) 取健康足月新生兒臍帶血，采用密度梯度離心法，得到單個(gè)核細(xì)胞。使用EGM ?-2MV（Lonza）培養(yǎng)基重懸上述細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至5～6×106/mL 后接種于預(yù)包被纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）的六孔板中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d 后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；以后每3～4 d 后換液1 次。細(xì)胞融合約90%則用胰酶消化按1:3 進(jìn)行傳代。

1.2.2 EPCs 的鑒定 采用雙熒光染色法及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法等技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定，具體方法同前[8]。

1.2.3 EPCs 分組及處理 高糖受損內(nèi)皮祖細(xì)胞：EPCs用30 mmo1/L 的葡萄糖的EGM-2 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 天。將造模成功的EPCs 分別用0、1、2、4、8、16 mg/L 的FA 進(jìn)行干預(yù)，確定FA 促高糖受損EPCs 增殖的最佳濃度。另將實(shí)驗(yàn)分為3 組：實(shí)驗(yàn)組、模型對(duì)照組、正常對(duì)照組（EPCs 用普通EGM-2 培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d）。實(shí)驗(yàn)組用最佳濃度的FA 處理，模型組和正常組均用等體積的PBS 處理。

1.3 FA 對(duì)高糖受損EPCs 生物學(xué)功能的影響

1.3.1 FA 處理高糖受損EPCs 最佳濃度的選擇 取增殖活躍的細(xì)胞接種于96 孔板，加FA 使其終質(zhì)量濃度分別為0、1、2、4、8、16 mg/L，作用24 h 后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，以確定最佳作用濃度。

1.3.2 增殖能力檢測(cè) 使用胰酶消化對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/孔接種于96 孔板；在37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁；取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96 孔板上，配制成100 μL 的細(xì)胞懸液；將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入8 mg/LFA 或PBS 進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h 后加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處OD 值；本組實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，每組設(shè)定3 復(fù)孔。

1.3.3 黏附能力檢測(cè) 使用胰酶消化貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞充分脫落后離心重懸浮于500 μL 培基中并計(jì)數(shù)，然后將同等數(shù)目細(xì)胞接種于24 孔板，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，分別用8 mg/L FA 和PBS液干預(yù)，培養(yǎng)8 h 后，將同等數(shù)目的EPCs 接種在包被有大鼠纖維連接蛋白培養(yǎng)板中，隨后在37 ℃下培養(yǎng)30 min，在2 個(gè)隨機(jī)200 倍視野下計(jì)算貼壁細(xì)胞數(shù)目。

1.3.4 成血管能力檢測(cè) Matrigel 基質(zhì)膠4℃過夜溶解后，采用M200無(wú)血清及生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的培養(yǎng)基按1:1稀釋Matrigel 基質(zhì)膠，按50 μL/孔加入12 孔板，37℃孵箱放置30 min。使用胰酶消化對(duì)數(shù)期的各組細(xì)胞，DMEM 重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/μL，每孔加入1 mL 重懸液，待細(xì)胞貼壁加入8 mg/L FA 或PBS 進(jìn)行干預(yù)。在37 ℃孵箱孵育培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)小管樣結(jié)構(gòu)。各組均隨機(jī)選取4 個(gè)視野計(jì)算小管數(shù)，取平均值。本組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 遷移能力檢測(cè) 先用Marker 筆在6 孔板背后每隔1 cm 畫一道橫線，橫穿過孔。每孔至少穿過5 條線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPCs，在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)1 d 后用無(wú)菌200 μL 槍頭在培養(yǎng)孔底部中央畫一道痕跡，用PBS 洗去脫落的細(xì)胞。分別用含有8 mg/L FA 和PBS 液的無(wú)血清M199 完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇2 個(gè)不同視野，用顯微標(biāo)尺，分別測(cè)量0 h 和24 h 的劃痕創(chuàng)面邊距并拍照。細(xì)胞遷移能力用遷移寬度表示。

1.3.6 SOD 檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第5 天換液，添加8 mg/L FA 或PBS，每組濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)48 h 后，提取細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒上的說明進(jìn)行檢測(cè)。在15 min之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的OD 值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 21.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1EPCs 的分離和培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，呈典型的鵝卵石樣，并表現(xiàn)出集落形態(tài)，中央細(xì)胞呈圓形，周邊細(xì)胞呈梭形，見圖1。

圖1 第7 天原代人EPCs 的形態(tài)（光鏡：A.×200；B.×400）

2.2 EPCs 的鑒定 原代人EPCs 細(xì)胞膜結(jié)合CD31 免疫熒光抗體呈綠色，細(xì)胞攝取DAPI核染呈藍(lán)色，融合圖像顯示膜染綠色熒光，核染藍(lán)色熒光，見圖2。細(xì)胞結(jié)合 FITC-UEA-I呈綠色，細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL 呈紅色，兩者雙染呈橙黃色改變的細(xì)胞即為正常分化的EPCs，見圖3。

圖2 CD31 抗體聯(lián)合DAPI核染鑒定結(jié)果（熒光鏡，×400）

圖3 雙熒光染色鑒定結(jié)果（熒光鏡，×400）

2.3 FA 處理對(duì)高糖受損EPCs 增殖曲線的影響 隨著FA 處理濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸升高，當(dāng)FA 濃度為8 mg/L 時(shí)，細(xì)胞活動(dòng)最高，16 mg/L 時(shí)逐漸降低，見圖4，因此本實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度8 mg/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖4 不同濃度FA 對(duì)高糖受損EPCs 增殖活性曲線圖

2.4 FA 對(duì)高糖受損EPCs 增殖、黏附、成血管及遷移能力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與正常EPCs 相比，模型組EPCs增殖能力、黏附能力、成管能力（成管數(shù)目）、遷移能力（遷移率）明顯下降（P＜0.05），而FA干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力、黏附能力、成血管能力、遷移能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖5，圖6，圖7，圖8。

圖5 FA 對(duì)高糖受損EPCs 增殖能力影響

圖6 FA 對(duì)高糖受損EPCs 黏附能力影響

圖7 FA 對(duì)高糖受損EPCs 成血管能力影響

圖8 FA 對(duì)高糖受損EPCs 遷移能力的影響

2.5 FA 對(duì)高糖受損EPCs 分泌SOD 的影響 ELISA檢測(cè)各組SOD 的活性，研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，高糖誘導(dǎo)損傷的 EPCs 的SOD 活性明顯下降（P＜0.05），8 mg/L 的FA 能夠提高高糖損傷EPCs 中SOD 的活性，但無(wú)明顯差異（P＞0.05），見圖9。

圖9 ELISA 檢測(cè)FA 對(duì)高糖受損EPCs 分泌SOD 的影響

3 討論

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的多病因代謝紊亂疾病[9]。糖尿病常見的長(zhǎng)期并發(fā)癥之一是創(chuàng)面愈合障礙，約占糖尿病患者非創(chuàng)傷性截肢的50%。一項(xiàng)關(guān)于糖尿病患者截肢原因的回顧性研究提示創(chuàng)面愈合困難是81%的患者截肢的主要原因[10]。糖尿病患者的傷口愈合困難的主要原因是因?yàn)檠苌衫щy和新生血管的損害。EPCs 是來(lái)自造血干細(xì)胞系的干/祖細(xì)胞前體，通常被稱為循環(huán)祖細(xì)胞，是負(fù)責(zé)內(nèi)皮修復(fù)和新生血管生成的特殊細(xì)胞。在適宜環(huán)境下，EPCs 可以促進(jìn)血管生成和血管修復(fù)，包括并入內(nèi)皮、釋放促進(jìn)修復(fù)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子[11]。研究[12]表明，在高血糖和糖尿病相關(guān)并發(fā)癥中，EPCs 的數(shù)量、功能和基因表達(dá)均受到損害。

糖尿病患者的高血糖狀態(tài)是內(nèi)皮功能障礙的主要原因。高糖通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致糖尿病患者EPCs功能障礙[13]，氧化應(yīng)激可促進(jìn)EPCs 凋亡[14]，并引起 EPCs 活性、遷移能力及成管等功能下降[15]。高血糖通過線粒體電子傳遞鏈過量產(chǎn)生超氧陰離子活性氧（ROS），后者在細(xì)胞功能障礙和糖尿病并發(fā)癥的病理生理學(xué)中起重要作用。因此，慢性高血糖可能導(dǎo)致自由基產(chǎn)生過多，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終影響創(chuàng)面的愈合。故尋找抗氧化應(yīng)激的藥物可能是預(yù)防糖尿病血管穩(wěn)態(tài)受損的重要治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A 可顯著提高高糖受損EPCs 的增殖、黏附、成管和遷移能力，表明FA 能保護(hù)高糖誘導(dǎo)損傷的EPCs。分離糖尿病患者EPCs，在體外用FA處理改善其功能，再用于自體EPCs 移植，有望提高自體細(xì)胞移植療效，使其更加有效地促進(jìn)血管生成和創(chuàng)面愈合，提高EPCs 治療效果，預(yù)防截肢。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下EPCs 中SOD 的活性明顯下降，8 mg/L 的FA 能夠提高其活性，但與對(duì)照組無(wú)明顯差異，可能與FA 的濃度選擇相關(guān)，亦可能與體外環(huán)境無(wú)法模擬體內(nèi)的具體環(huán)境有關(guān)。目前EPCs 治療尚未形成一套標(biāo)準(zhǔn)的表型和功能分析，亦未對(duì)細(xì)胞體內(nèi)外環(huán)境的綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化。