魏君冉，梁旭方，徐晶，蔡文靜

華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院/華中農(nóng)業(yè)大學鱖魚研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室/湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，武漢 430070

瘦素(leptin)在1994年首次在小鼠(Musmusculus)中被發(fā)現(xiàn)，并描述為一種由肥胖基因(obese gene，ob)編碼的、由脂肪細胞分泌的多肽激素[1]。在哺乳動物中，leptin由脂肪組織合成并分泌進入血液，通過血腦屏障后到達下丘腦并與瘦素受體(leptin receptor,lepR)結(jié)合，導致食欲降低和脂質(zhì)代謝增加[2]。繼leptin被發(fā)現(xiàn)后，Tartaglia等[3]隨即在小鼠中克隆出lepR基因。已有的研究表明，哺乳動物只有一個lepR基因的旁系同源物，lepRmRNA通過3′端的可變剪切形成6種不同的亞型，這6種不同的亞型可分為長型(lepRb)、短型(LepRa、LepRc、LepRd、LepRf)、分泌型(lepRe)3類[4]。自首次發(fā)現(xiàn)小鼠的lepR基因十多年后[3]，Wong等[5]首次在海洋青鳉(Oryziasmelastigma)中發(fā)現(xiàn)魚類的lepr基因。不同于哺乳動物的是，在大多數(shù)魚類中只克隆出長型lepr，如日本青鳉(Oryziaslatipes)[6]、斑馬魚(Daniorerio)[7]和斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[8]等。在少數(shù)魚類中通過cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification of cDNA,RACE)克隆出多個由leprmRNA 3′端可變剪切產(chǎn)生的受體亞型，如虹鱒 (Oncorhynchusmykiss)[9]，黑鯽(Carassiuscarassius)[10]和歐洲鱸 (Dicentrarchuslabrax)[11]。

魚類長型受體具備哺乳動物lepR高度保守的結(jié)構(gòu)，短型受體亞型的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成及序列長度均存在差異，分泌型受體通常缺乏胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)。與哺乳動物一致，魚類的lepr只有長型受體亞型具備完全的重要功能域。在虹鱒[9]、大西洋鮭(Salmosalar)[12]及黑鯽[10]中的研究發(fā)現(xiàn)短型受體亞型可能與能量穩(wěn)態(tài)有關(guān)。對于魚類可溶性leptin受體的研究發(fā)現(xiàn)其與leptin-a的結(jié)合能力高于leptin-b，隨著對多種魚類的lepr基因的鑒定和研究的深入，發(fā)現(xiàn)lepr及其leptin結(jié)合域(leptin binding domain，LBD)在魚類進化過程中相對保守[7-8,11,13]。

在哺乳動物及魚類中，leptin通過其專一性受體結(jié)合傳導抑食欲信號[14-15]。使用哺乳動物同源重組的leptin蛋白處理金魚可導致其攝食量下降[16]，與在哺乳動物中觀察到的結(jié)果一致，但類似的處理并不能影響銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)[17]、鯰(Silurusasotus)[18]和綠海魴(Lepomiscyanellus)[19]的攝食行為。這些不同的結(jié)果可能是魚類和哺乳動物的leptin及l(fā)epr氨基酸序列差異較大引起的。因此，研究魚類leptin及l(fā)epr的結(jié)構(gòu)和功能對于研究魚類攝食行為來說至關(guān)重要。鱖是我國特有的名貴淡水魚，其食性奇特，自開口起終身以活餌為食，但經(jīng)長期馴化才可食人工飼料。本課題組在前期研究氨基酸、腦腸肽(PYY)對鱖攝食調(diào)控等[20-21]工作的基礎上，利用3′ RACE 技術(shù)，克隆鱖由mRNA的3′端可變剪切4個不同的lepr受體亞型，檢測長型受體亞型在鱖組織中的表達情況，以及注射鱖同源重組leptin蛋白對其在腦中表達的影響，以期為后續(xù)深入研究鱖不同亞型的lepr在攝食調(diào)控、生理代謝中的功能及l(fā)eptin-a和leptin-b的基因功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及飼養(yǎng)條件

試驗魚來自華中農(nóng)業(yè)大學鱖魚研究中心，于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鱖魚育種創(chuàng)新基地的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)14 d，水溫為(25±1) ℃，pH為7.53～7.70，氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮質(zhì)量濃度均低于0.1 mg/L，每天09：00和17：00各飽食投喂鮮活麥鯪(Cirrhinusmrigala)1次。

1.2 鱖leptin A和leptin B同源重組蛋白的表達、純化及腹腔注射

鱖leptin A和leptin B同源重組蛋白的表達和純化方法參照Yuan等[22]的方法進行。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機選取9尾健康、體表無傷、質(zhì)量為(230±16) g的鱖，饑餓24 h后，使用MS-222麻醉后稱取質(zhì)量。采用腹腔注射的方法，試驗組注射1 000 ng/g的溶解于DPBS的leptin A或leptin B同源重組蛋白，對照組注射等量的DPBS溶液，每組注射12尾試驗魚。

1.3 組織的獲取及RNA的提取

取樣前，手術(shù)刀、手術(shù)剪及1.5 mL離心管均于37 ℃下質(zhì)量分數(shù)為0.1%的焦碳酸乙二酯(DEPC)浸泡12 h，隨后使用高壓滅菌鍋于120 ℃下處理30 min以去除DEPC，烘干后密封保存?zhèn)溆谩ｗZ經(jīng)MS-222麻醉后，解剖提取3尾試驗魚的垂體組織，所獲得的垂體組織置于1.5 mL離心管并立即凍存于液氮中，取樣結(jié)束后凍存于-80 ℃，用于后續(xù)lepr的3′- RACE克隆。取6尾試驗魚的端腦、中腦、小腦、垂體、下丘腦、延腦、肝臟、腸、腎、脂肪組織、鰓、脾和心組織置于1.5 mL離心管并立即凍存于液氮中，用于后續(xù)檢測lepr基因的組織表達。分別在注射鱖leptins同源重組蛋白2 h及4 h后取每組鱖的腦組織，置于1.5 mL離心管并立即凍存于液氮中。

將用于lepr的3′- RACE克隆的垂體組織混合，其余組織取適量放入干凈的1.5 mL離心管中，向裝有組織的離心管中加入1 mL TRIzol 試劑，并裝載入-20 ℃預冷的組織破碎儀夾板中，充分勻漿后按照有機溶劑抽提RNA法提取組織RNA。RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后用于后續(xù)試驗。

1.4 3′ RACE 引物設計及l(fā)epr cDNA全長克隆

從鱖基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取lepr基因序列，根據(jù)TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒的說明和lepr基因的核心序列設計外引物Lepr- Outer，以及內(nèi)引物Lepr-Inner，用于擴增lepr的cDNA全長序列。用于3′RACE克隆的引物如表1所示。

表1 本研究中所使用的克隆及定量引物 Table 1 Primers used for clone and qRT-PCR in this study

使用TaKaRa公司的3′-Full RACE Core Setver2.0以及DNA聚合酶(TaKaRa，日本)合成鱖lepr基因cDNA全長序列。根據(jù)試劑盒的使用說明操作，獲得PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測無誤后用于連接、轉(zhuǎn)化。

1.5 lepr基因3′RACE克隆產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化及測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠并使用Omega公司的EZNA Gel Extraction Kit試劑盒進行純化回收，并連接入T克隆載體(北京全式金公司，pEASY?-T1 Cloning Kit)。將克隆載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞(北京全式金公司)，用不含有氨芐的LB培養(yǎng)液在37 ℃的搖床中培育1 h后，吸取200 μL菌液涂于含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性克隆送武漢生工生物工程有限公司測序。

1.6 不同亞型的lepr基因的生物信息學分析

使用NCBI網(wǎng)站的BLAST及ORF finder工具將測序結(jié)果與鱖基因組調(diào)取的lepr序列進行比對，并預測其氨基酸序列。分別使用在線軟件Signal P 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/)，TMpred Server (https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)及SMART:Main page (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測測序所得的lepr序列的信號肽、跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域。從GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)獲取以下15個物種的lepr氨基酸序列：人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、爪蟾(Xenopustropicalis)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、歐洲鱸、羅非魚(Dreochromisniloticus)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、虹鱒、大西洋鮭、日本青鳉、斑馬魚、黑鯽，利用Bioedit軟件對上述氨基酸序列進行多重比對，并使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建上述物種lepr蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹(bootstrap=1 000)。

1.7 qRT-PCR

通過qRT-PCR技術(shù)檢測DNA的表達水平。20 μL反應體系：ChamQ SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，南京)10 μL，F(xiàn)/R引物0.4 μL，模板cDNA 1 μL，雙蒸水8.2 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性5 min； 95 ℃變性15 s，引物特異性退火溫度下30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。溶解曲線以0.5 ℃/s的速度從95 ℃降低至65 ℃，每6 s采集1次信號。

2 結(jié)果與分析

2.1 lepr cDNA 3′RACE克隆

使用3′ RACE技術(shù)克隆獲得leprcDNA，發(fā)現(xiàn)4個不同大小的DNA片段。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)這4個DNA片段均為leprmRNA經(jīng)3′可變剪切產(chǎn)生的不同亞型，長度分別為3 474、1 512、945和915 bp。

2.2 lepr基因與氨基酸序列分析

將使用3′RACE技術(shù)克隆得到的4條序列與從鱖基因組中獲取的lepr序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)1個長型受體亞型lepr-L，3個由mRNA 3′端可變剪切產(chǎn)生的短型受體亞型：lepr-S1、lepr-S2、lepr-S3(圖1)。lepr-L的CDS長度為3 474 bp，編碼1 157個氨基酸；短型受體亞型lepr-S1、lepr-S2和lepr-S3的CDS長度分別為1 512、945和915 bp，分別編碼503、314和304個氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)，鱖lepr-L蛋白具有1個信號肽結(jié)構(gòu)、1個跨膜區(qū)、1個免疫球蛋白(Ig) C2-like結(jié)構(gòu)域、1個LBD結(jié)構(gòu)域，2個FNIII結(jié)構(gòu)域和2個重復的色氨酸/絲氨酸基序(WSXWS)，含有JAK和STAT功能域等全部胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。除lepr-S1蛋白具備不完整的LBD結(jié)構(gòu)域外，其余2個短型受體亞型均不具備LBD結(jié)構(gòu)域，同時，所有短型受體亞型均丟失跨膜區(qū)和所有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(圖2)。如表2所示，鱖lepr-L的氨基酸序列與魚類同源性高(42%～86%)，與哺乳動物同源性低(26%～28%)。

下劃線部分氨基酸序列為lepr保守結(jié)構(gòu)。The amino acid sequence of lepr gene conserved domains are underlined.

表2 鱖與其他脊椎動物LBD結(jié)構(gòu)域氨基酸序列同源性比較 Table 2 Amino acid homology comparisonof LBD domain between Chinese perch and other vertebrates

黑色方塊表示 “WSXWS”基序；箭頭位置指示終止密碼子； TM:跨膜區(qū)。The black bar means “WSXWS” motif; arrows indicates the location of stop codon; TM:Transmembrane domain.

2.3 lepr氨基酸序列多重比對和進化樹分析

鱖lepr-L亞型的LBD序列與其他物種氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，鱖與石斑魚、羅非魚和歐洲鱸同源性最高(75%～87%)，其次是虹鱒和大西洋鮭(48%)，與斑馬魚、黑鯽、小鼠和人同源性最低(31%～42%)(圖3)。

黑色底紋表示氨基酸序列一致 Black shading indicates that the amino acid sequence is consistent.

比對16個不同物種的lepr氨基酸序列并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。如圖4所示，lepr進化樹整體分為2支，哺乳動物和兩棲動物的lepr聚為一支，魚類的lepr聚為另一支。鱖與鱸形目魚類的lepr的親緣關(guān)系最近，其次為鮭鱒類，與鯉科魚類的親緣關(guān)系最遠。

圖4 脊椎動物lepr氨基酸系統(tǒng)進化樹

2.4 lepr在鱖各組織中的表達情況

圖5所示為lepr-L在鱖各組織器官中的表達情況。在鱖中，lepr-L在鰓中表達量最高，其次是腎、垂體、腸、脾、脂肪組織、心、肝、中腦、下丘腦和小腦，在小腦和端腦中表達量最低。

T：端腦 Telencephalon； M：中腦 Midbrain； C：小腦 Cerebellum； P：垂體 Pituitary； Ht：下丘腦 Hypothalamus； MO：延腦 Medulla oblongata； L：肝臟 Liver； I：腸 Intestines； K：腎臟 Kidney； A：脂肪組織 Adipose； G：鰓 Gill； S：脾臟 Spleen； H：心臟 Heart.

2.5 腹腔注射鱖leptin A和leptin B同源重組蛋白對腦lepr-L表達的影響

圖6所示為腹腔注射鱖同源重組leptin A和leptin B 2 h和4 h后，腦組織中l(wèi)epr-L的表達情況。注射leptin A 2 h和4 h對鱖腦組織中l(wèi)epr-L的表達均無顯著影響(P>0.05)；注射leptin B 2 h鱖腦組織中l(wèi)epr-L的表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，注射leptin B 4 h后未觀察到鱖腦組織中l(wèi)epr-LmRNA豐度的顯著變化(P>0.05)。

含有不同字母的組別之間存在顯著性差異(P <0.05)，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示(n=6)。Values within the same row with superscripted letters represent significant difference (P<0.05),data are expressed as mean±S.E (n=6).

3 討 論

本研究采用3′ RACE克隆的方法，獲得了由mRNA 3′端可變剪切產(chǎn)生鱖的4種lepr亞型，包括1個長受體亞型和3個短受體亞型。氨基酸多重比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，鱖lepr及其LBD區(qū)域均較為保守，與同屬鱸形目的歐洲鱸和石斑魚的同源性最高，親緣關(guān)系最近，其次是鯉科魚類，與兩棲動物和哺乳動物的同源性較低，親緣關(guān)系最遠。這與在其他鱸形目魚類中得到的結(jié)果相一致[8,11,24]。

本研究中使用3′ RACE克隆得到鱖的4種亞型的lepr，與哺乳動物和其他魚類一致的是，長型受體亞型lepr-L具有完整的功能結(jié)構(gòu)域，包括：信號肽、LBD、FNIII，重復的WSXWS、Ig-C2-like、跨膜區(qū)、細胞膜內(nèi)的JAK-STAT結(jié)構(gòu)域。鱖lepr-S1含有LBD，完全缺失了跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域，推測其可能是可溶性leptin受體。在哺乳動物和魚類中，可溶性受體與循環(huán)瘦素結(jié)合，避免瘦素被降解，進而調(diào)節(jié)瘦素的濃度和活動[9,23,25]。鱖短受體亞型lepr-S1結(jié)構(gòu)與哺乳動物和虹鱒的可溶性受體相似，我們推測鱖短受體亞型lepr-S1應當具備分泌型受體的功能，可能具備調(diào)節(jié)血漿leptin濃度的功能。而鱖短型受體亞型lepr-S2和lepr-S3僅含有一個WSXWS，未見其他重要結(jié)構(gòu)域，在其他魚類中均未見報道類似的短型受體亞型，其生理功能還需進一步探究。

在魚類中，lepr在各組織中的表達分布情況與物種相關(guān)，例如在金魚[26]、歐洲鰻鱺[27]和大西洋鮭[12]的端腦、下丘體和性腺中l(wèi)epr表達量最高，在羅非魚的垂體中l(wèi)epr表達最多，其次是肌肉和頭腎[26]，日本青鳉的lepr則在肌肉中表達量最高，其次是皮膚和鰓[6]。在我們的研究中，鱖lepr-L在鰓中表達最高，其次是腎臟和垂體。此類lepr組織表達分布的差異可能說明leptin在不同的物種中發(fā)揮的作用不盡相同。

在哺乳動物中，leptin作為一種飽食因子，通過與專一性受體lepr結(jié)合發(fā)揮其抑制食欲的生理功能[14-15]。草魚[28]、鱖[22]、羅非魚[29]等魚類腹腔注射同源重組的leptin蛋白后均表現(xiàn)出食欲降低，因此，leptin在魚類中也被認為具有抑制食欲的作用。同時，敲除lepr基因的日本青鳉也表現(xiàn)出食欲增強[30]，也驗證了上述觀點。然而，lepr敲除的斑馬魚卻未表現(xiàn)出食欲的增加[31]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，腹腔注射鱖leptin B同源重組蛋白2 h后，鱖食欲顯著降低[22]，腦中l(wèi)epr的表達量隨之升高，在注射4 h后，鱖食欲恢復的同時[22]，腦中l(wèi)epr的表達量也隨之降低；而注射鱖leptin A同源重組蛋2 h及4 h后，既未觀察到食欲明顯降低[22]，也未觀察到腦組織中l(wèi)epr表達的變化。由此，我們推測，魚類不同的leptins在不同的組織中對lepr表達的影響不一致，從而行使不同的生理功能。

本研究首次克隆出由mRNA 3′端可變剪切產(chǎn)生的鱖lepr的4個受體亞型。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，僅長型受體lepr-L具有完整的功能結(jié)構(gòu)域，且各功能結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度保守。短型受體亞型lepr-S1完全缺失跨膜區(qū)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，推測其為可溶性受體亞型，發(fā)現(xiàn)了2個在其他魚類中未見報道的、僅具備1個WSXWS結(jié)構(gòu)的lepr短型受體亞型。鱖lepr基因在鰓、腎和垂體中表達量較高；注射鱖leptin B而非leptin A的同源重組蛋白會引起腦lepr表達量上升。這些結(jié)果說明鱖leptins能引起組織中l(wèi)epr的表達的不同變化而發(fā)揮獨特的生理功能。