王旭東,唐雨甜，熊雪梅,周佳佳,李相珊,曹樹洪,高澤霞,4

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心/長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070；2.武漢農(nóng)業(yè)檢測中心，武漢 430023；3.湖北省陽新縣浮屠鎮(zhèn)水產(chǎn)服務(wù)中心，黃石 435239； 4. 湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)作為我國大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一，肌間骨的存在嚴(yán)重影響了其食用和深加工價值。肌間骨(intermuscular bones,IBs)僅存在于低等真骨魚類中，由肌膈間的肌腱骨化而來。對肌間骨的相關(guān)研究中，形態(tài)學(xué)研究較多[1]。近年來，魚類肌間骨分子機(jī)制研究取得了較大進(jìn)展。Yang等[2]、Su等[3]、Zhang等[4]對BMP家族基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明部分BMP家族基因與肌間骨發(fā)生發(fā)育密切相關(guān)；Nie等[5-6]、Wan等[7-8]分別對肌間骨相關(guān)的組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，揭示了肌間骨發(fā)育中重要的候選基因和microRNA。在分子育種研究中，Tang等[9]研究表明鏡鯉肌間骨數(shù)量性狀遺傳力屬于中等遺傳力，并發(fā)現(xiàn)8個肌間骨QTLs和29個肌間骨相關(guān)的候選基因。Xiong等[10]評估顯示，團(tuán)頭魴脈弓小骨數(shù)量性狀遺傳力為0.37，屬于中等遺傳力。Wan等[11]首次利用混合分組分析法篩選出181個與肌間骨數(shù)量相關(guān)的候選SNP位點(diǎn)。Perazza等[12]發(fā)現(xiàn)無肌間骨大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)群體，Nunes等[13]通過GWAS分析獲得了與大蓋巨脂鯉肌間骨數(shù)量顯著相關(guān)的675個SNP位點(diǎn)，并且有13個位點(diǎn)位于骨相關(guān)的候選基因附近。目前，基因多態(tài)性已被證實(shí)與魚類生長[14]、抗病[15-16]、繁殖[17]、耐低氧[18]等多種性狀有關(guān)聯(lián)，因此，針對魚類肌間骨性狀的分子育種具有可行性。

Scleraxis (scx)是肌腱早期發(fā)育中的一個特異性的標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子，對肌腱組織的分化起到重要作用[19]。Kague等[20]通過敲除斑馬魚scxa和scxb基因，發(fā)現(xiàn)scx基因在斑馬魚肌腱發(fā)育和骨骼礦化過程中發(fā)揮作用。Nie等[21]的研究表明scxa基因?qū)︳~類肌間骨的數(shù)目具有一定的調(diào)控作用。因此，研究scxa基因的多態(tài)性與團(tuán)頭魴肌間骨數(shù)量性狀之間的關(guān)聯(lián)性，篩選與團(tuán)頭魴肌間骨數(shù)量顯著相關(guān)的分子標(biāo)記具有重要意義，可為少刺團(tuán)頭魴品種選育提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用團(tuán)頭魴均來自湖北百容水產(chǎn)良種有限公司。參考萬世明等[22]的肌間骨數(shù)目統(tǒng)計(jì)方法，對640尾團(tuán)頭魴進(jìn)行肌間骨數(shù)目計(jì)數(shù)(在進(jìn)行肌間骨數(shù)目統(tǒng)計(jì)前，采集樣本的體長等生物學(xué)信息，并用無水乙醇保存尾鰭鰭條，最終選取24尾肌間骨數(shù)目不大于102的個體，21尾肌間骨數(shù)目不小于129的個體構(gòu)建肌間骨數(shù)目極端群體。采用醋酸銨/異丙醇法提取DNA。

1.2 團(tuán)頭魴scxa基因克隆

從Ensembl(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)上查找斑馬魚scxa基因序列，與團(tuán)頭魴二代全基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，獲得匹配的DNA序列及其相應(yīng)的染色體坐標(biāo)，與團(tuán)頭魴二代測序轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對，獲得團(tuán)頭魴scxa基因序列結(jié)構(gòu)及相應(yīng)染色體坐標(biāo)，使用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測開放閱讀框，利用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)驗(yàn)證和翻譯序列。使用Primer Premier 5.0對團(tuán)頭魴scxa基因序列設(shè)計(jì)引物(見表1)，送至武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。以肌間骨數(shù)量極端個體的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測產(chǎn)物質(zhì)量后，送至武漢擎科生物科技有限公司測序。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白的理化性質(zhì)；ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親疏水性；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；使用DNAMAN對不同脊椎動物scx基因進(jìn)行同源性分析，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 團(tuán)頭魴scxa基因組織表達(dá)分析

Trizol法提取1齡團(tuán)頭魴8個組織的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)其定量引物(表1)，以β-actin為內(nèi)參基因。使用ABI QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀(Thermo Scientific，美國)檢測scxa基因在團(tuán)頭魴8個組織的表達(dá)情況，按照HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox Plus)(翊圣，上海)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個樣品設(shè)置3個平行，PCR程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；95 ℃，10 s；62 ℃，20 s；72 ℃，20 s; 95 ℃，15 s； 62 ℃，1 min; 95 ℃，15 s。用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)水平，使用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(α=0.05)。

表1 引物信息 Table 1 Primer information

1.4 肌間骨數(shù)量關(guān)聯(lián)性SNP位點(diǎn)篩選

將測序獲得的肌間骨數(shù)量極端個體scxa基因序列用DNAMAN進(jìn)行多序列比對，獲取突變位點(diǎn)；用Chromas分析突變位點(diǎn)的基因型，統(tǒng)計(jì)多肌間骨組和少肌間骨組在突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率；用SPSS 26.0計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率與多(或少)肌間骨數(shù)目的顯著性。使用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/)進(jìn)行單倍型分析，并使用Cervus3.0對多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行遺傳參數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 團(tuán)頭魴scxa基因理化性質(zhì)分析

團(tuán)頭魴scxa基因開放閱讀框?yàn)?09 bp；編碼202個氨基酸，分子式為C935H1511N297O308S8,分子質(zhì)量為22.10 ku；理論等電點(diǎn)(pI值)為9.41，為堿性蛋白；氨基酸殘基中Ser(14.4%)含量最高(圖1)；不穩(wěn)定系數(shù)為56.81，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為60.40，平均親水性為-0.834，表明該蛋白為強(qiáng)親水性，為可溶性蛋白；該蛋白不存在跨膜區(qū)域。

圖1 團(tuán)頭魴scxa基因氨基酸頻率分布圖

2.2 團(tuán)頭魴scxa基因氨基酸序列分析

經(jīng)同源性分析(圖2)發(fā)現(xiàn)：團(tuán)頭魴scxa基因氨基酸序列與鯽(75.40%)、鯉(74.60%)、金線鲃(73.41%)、斑馬魚(72.22%)scxa基因氨基酸序列同源性較高；scxa基因氨基酸序列存在79個保守的位點(diǎn)。從氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，相對鳥類、哺乳動物等外群，魚類scxa基因氨基酸序列中存在9個氨基酸缺失(圖3)。使用MAGE X構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)，主要聚為3個分支：魚類scx、魚類scxa/b和其他動物scx。團(tuán)頭魴scxa與鯉、鯽、斑馬魚和金線鲃同源性較高。聚類結(jié)果顯示，鯉、鯽、金線鲃、斑馬魚和團(tuán)頭魴聚為一類；斑點(diǎn)叉尾鮰、黃顙魚聚為一類；半滑舌鰨、青鳉、紅鰭東方鲀和尼羅羅非魚聚為一類；原雞、非洲爪蟾、牛、人、小鼠聚為一類。

1：鯽 Carassius auratus； 2：鯉 Cyprinus carpio； 3：金線鲃 Sinocyclocheilus grahami； 4：斑馬魚 Danio rerio； 5：納氏鋸脂鯉 Pygocentrus nattereri； 6：斑點(diǎn)叉尾鮰 Ictalurus punctatus； 7：墨西哥脂鯉 Astyanax mexicanus； 8：黃顙魚 Tachysurus fulvidraco； 9：大西洋鯡 Clupea harengus； 10：大西洋鮭 Salmo salar； 11：斑點(diǎn)雀鱔 Lepisosteus oculatus； 12：美麗硬骨舌魚 Scleropages formosus； 13：原雞 Gallus gallus； 14：半滑舌鰨 Cynoglossus semilaevis； 15：尼羅羅非魚 Oreochromis niloticus； 16：牛Bos taurus； 17：小鼠 Mus musculus； 18：人Homo sapiens； 19：青鳉 Oryzias latipes； 20：多育花巖鳉 Poeciliopsis prolifica； 21：紅鰭東方鲀 Takifugu rubripes； 22：非洲爪蟾 Xenopus tropicalis.

黑色方框表示魚類缺失的氨基酸序列。 The black box indicates the amino acid sequence missing from fish.

2.3 scxa基因在團(tuán)頭魴不同組織的表達(dá)分析

定量表達(dá)分析結(jié)果顯示，scxa在肌間骨和肌肉中表達(dá)量相對較高，與其他組織中的表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05)，scxa基因在肌肉中的表達(dá)量顯著高于在肌間骨中的表達(dá)量(P<0.05)(圖5)。

圖4 scx基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

1:肌間骨 Intermuscular bone; 2:肌肉 Muscle; 3:腦 Brain; 4:鰭 Fin; 5:心 Heart; 6:肝 Liver; 7:脾 Spleen; 8:肋骨 Rib.不同的小寫字母表示scxa在不同組織中的差異顯著性(P<0.05).Lowercase letters indicates the significant difference for scxa in the different tissues,respectively (P<0.05).

2.4 scxa基因多態(tài)性與團(tuán)頭魴肌間骨數(shù)量的相關(guān)性

基于所檢測的團(tuán)頭魴群體，scxa基因在肌間骨較多和較少群體個體中的多態(tài)性位點(diǎn)信息如表2所示， 2個SNP位點(diǎn)和1個插入缺失位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在2個極端群體存在顯著性差異(P<0.05)。其中，SNP位點(diǎn)chr09_22667389位于第一外顯子，chr09_22661743位于第二外顯子；插入缺失位點(diǎn)chr09_22661345-chr09_22661344位于第二外顯子(圖6)。單倍型分析中，剔除頻率小于3%的組合，共發(fā)現(xiàn)3種單倍型；其中Haplotype 1 頻率(0.73)最高，Haplotype 2 頻率(0.05)最低(表3)。chr09_22661743、chr09_22661345-22661344、chr09_22667389位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量分別為0.239 2、0.246 1和0.258 3。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，3個位點(diǎn)的觀測雜合度的數(shù)值范圍為0.087 0～0.238 1，期望雜合度的數(shù)值范圍為0.284 6～0.311 2，無有效等位基因的數(shù)值范圍為0.076 9～0.533 3(表4)。

圖6 團(tuán)頭魴scxa多態(tài)性位點(diǎn)定位信息

表2 團(tuán)頭魴肌間骨數(shù)量性狀顯著相關(guān)突變位點(diǎn)信息 Table 2 The SNPs information related to the number traits of IBs in M. amblycephala scxa gene

表3 scxa基因外顯子多態(tài)性位點(diǎn)單倍型分析 Table 3 Haplotype analysis of polymorphic sites in the exon of scxa gene

表4 scxa基因3個多態(tài)性位點(diǎn)的遺傳參數(shù) Table 4 Genetic parameters of 3 polymorphic loci in scxa gene

3 討 論

本研究通過高通量測序和基因克隆技術(shù)獲得團(tuán)頭魴scxa基因的cDNA序列，通過ProParam進(jìn)一步分析scxa基因的理化性質(zhì)，為研究scxa基因?qū)τ趫F(tuán)頭魴肌間骨發(fā)生發(fā)育的作用提供理論依據(jù)。對該基因編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴scxa與鯉、鯽等鯉科魚類scxa具有高度同源性，與其他物種的scxa同源性相對較低。而且scxa在不同進(jìn)化地位的魚類中也存在差異。另外，scxa存在79個氨基酸保守位點(diǎn)；魚類的氨基酸序列相對于哺乳類存在一段9個氨基酸的缺失，推測這段缺失的氨基酸序列可能與物種所處的進(jìn)化地位有關(guān)。

Nie等[21]研究發(fā)現(xiàn)scxa基因敲除斑馬魚肌間骨數(shù)量顯著減少。本研究定量結(jié)果顯示，scxa基因在團(tuán)頭魴肌肉中的表達(dá)量最高，在肌間骨中表達(dá)量次之。已有研究表明，scx在哺乳動物肌腱發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。例如，Sakabe等[23]發(fā)現(xiàn)scx基因缺失小鼠在發(fā)育過程中肌腱完全缺失，導(dǎo)致異位骨化現(xiàn)象；陳宇龍等[24]定量分析了團(tuán)頭魴tnmd基因在團(tuán)頭魴肌間骨發(fā)育過程的4個關(guān)鍵時期表達(dá)情況，結(jié)果表明tnmd基因的表達(dá)情況與肌間骨的發(fā)育存在同步性。Shukunami等[25]研究表明scx基因促進(jìn)tnmd表達(dá)，正向調(diào)節(jié)肌腱細(xì)胞的分化和成熟。因此，我們可以推測scxa基因在魚類肌間骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

本研究在團(tuán)頭魴scxa基因外顯子上獲得2個與多肌間骨數(shù)量性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，這2個位點(diǎn)均為轉(zhuǎn)換類型。研究表明其轉(zhuǎn)換發(fā)生概率通常比其他幾個位點(diǎn)變異更高，這是因?yàn)榧?xì)胞中胞嘧啶大多甲基化并自發(fā)除去氨基以形成胸腺嘧啶[26]。研究[27]表明基因編碼區(qū)SNP在外顯子上的突變率為其周圍序列的1/5，但位于基因編碼區(qū)的SNP突變會對該基因的表達(dá)產(chǎn)生潛在影響，從而可能對表型變化發(fā)揮作用。因此，編碼區(qū)SNP對生物育種有重要意義。多態(tài)信息含量與雜合度是群體內(nèi)遺傳變異的測度，其值的高低反映了群體內(nèi)個體的均質(zhì)度，遺傳變異大，數(shù)值就高。但由于不同標(biāo)記得出的數(shù)值有很大的差異，Vaiman 等[28]提出了確定位點(diǎn)多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)：PIC>0.5 為高度多態(tài)座位，PIC<0.25 為低度多態(tài)座位，0.25

INDEL是指在近緣種或同一物種不同個體之間基因組同一位點(diǎn)的序列發(fā)生不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比對產(chǎn)生空位的現(xiàn)象。INDEL分子標(biāo)記在動植物遺傳育種中得到了廣泛應(yīng)用[29]。本研究獲得的chr09_22661345-chr09_22661344位點(diǎn)僅存在于多肌間骨個體中，并且該位點(diǎn)發(fā)生變異時， chr09_22667389、chr09_22661743分別也會產(chǎn)生變異，但這種連鎖關(guān)系并不雙向發(fā)生。由此推測，該位點(diǎn)的變異會影響其他多肌間骨關(guān)聯(lián)性SNP位點(diǎn)的發(fā)生，但需要擴(kuò)大樣本做進(jìn)一步驗(yàn)證。目前對于肌間骨發(fā)育關(guān)鍵基因上的SNP位點(diǎn)尚未有研究報道，但肌間骨數(shù)量相關(guān)SNP位點(diǎn)的篩選和應(yīng)用將有助于快速活體檢測魚類肌間骨數(shù)量信息，相對于傳統(tǒng)解剖學(xué)肌間骨計(jì)數(shù)法更加節(jié)省資源，從而促進(jìn)相關(guān)育種研究的進(jìn)展。