楊 鶯， 姚新月， 李海波

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 沈陽 110032； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生部， 沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 沈陽 110847)

炎癥是指機(jī)體受到外界刺激時所產(chǎn)生的防御反應(yīng)，正常情況下炎癥有利于清除致病炎癥因子。但過度的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致機(jī)體組織損傷使病情加重，如神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎等[1-2]。迄今在臨床使用的抗炎藥主要包括甾體抗炎藥(如地塞米松)和非甾體抗炎藥(如阿司匹林)。但因為其諸多不良反應(yīng)(如引起類腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)癥、嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)等)，限制了其在臨床的應(yīng)用[3-4]，因此研發(fā)高效、低毒的抗炎藥物是目前研究的重點。

山楂又稱山里紅，來源于薔薇科植物山里紅或山楂的干燥成熟果實，具有消食健胃、行氣散瘀之功效[5]。山楂葉富含黃酮類化合物，其中金絲桃苷(hyperoside, Hyp)是其主要活性成之一，具有廣泛的藥理活性，主要包括抗氧化、抗腫瘤、抗缺血性腦卒中等[6-9]。但是Hyp能否通過激活Sirt6抗炎作用未見報道。因此，本研究擬采用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥損傷，探索山楂葉提取物金絲桃苷是否通過調(diào)控Sirt 6發(fā)揮抗炎作用，為其臨床用于抗炎癥相關(guān)疾病提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

圖1示，山楂葉提取物金絲桃苷(Hyp)由遵義醫(yī)科大學(xué)高建美教授贈予，純度 ≥98%。采用二甲基亞砜溶解Hyp后配成10 mmol.L-1母液，在超凈臺內(nèi)采用0.22 μmol/L微孔濾器過濾除菌，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 Hyp高效液相色譜圖

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，采用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)液(#8116408)，Gibco公司；LPS(#L2630)、MTT(#M2128)，Sigma公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(#20171015)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)(#20171015)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)(#20171123)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase, iNOS)(#20171123)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒，上海江萊上海江萊生物科技有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 和iNOS及 β-actin引物合成、Trizol和DEPC，上海生工生物工程股份有限公司；anti-p-p38 (#ab47363) 多克隆抗體、anti-p38(#ab170099)多克隆抗體、anti-p-核轉(zhuǎn)錄因子κB p65(nuclear factor-κB, NF-κB p65)(#ab86299)多克隆抗體、anti- NF-κB p65多克隆抗體(#ab16502)、沉默信息調(diào)節(jié)因子6(sirtuin 6, Sirt6, #ab88494)，Abcam公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)；CFX96型RT-PCR儀 (Bio-Rad公司)；DDY-10型三恒電泳儀(Bio-Rad公司)；半干轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad公司)；全自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 Hyp對RAW264.7細(xì)胞活力的影響 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以1×105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的Hyp(0 μmol/L, 1.563 μmol/L, 3.125 μmol/L, 6.25 μmol/L, 12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L)作用24 h確定Hyp的安全濃度范圍；將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型組、模型組+ Hyp低濃度組、模型組+ Hyp中濃度組、模型組+ Hyp高濃度組、模型組+ 地塞米松組。LPS(1 μg/ml)和不同濃度(25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L)的Hyp或地塞米松(20 μmol/L)作用24 h后，加入MTT(5 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄上清，每孔加入DMSO(150 μL)，振搖10 min，于570 nm波長處測定吸光度值。

1.4.2 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO含量的影響 RAW264.7細(xì)胞按照1.4.1項方法處理后取上清，采用Griess法檢測細(xì)胞內(nèi)NO含量，取50 μL上清液與等體積的Griess試劑混合，在室溫下培養(yǎng)15 min。在540 nm波長的條件下檢測吸光度，并利用已知濃度的亞硝酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)，計算各組對應(yīng)的實際濃度值。

1.4.3 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 RAW264.7細(xì)胞按照1.4.1項方法處理后取上清，采用ELISA法測定NO和TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。取40 μL稀釋液與10 μL上清液混合，置于37 ℃條件下反應(yīng) 30 min后，將濃縮液稀釋按照要求稀釋用于洗滌各孔；移取50 μL酶標(biāo)液加入各孔充分反應(yīng)30 min(37 ℃條件下)；移取50 μL A、B顯色劑，37 ℃環(huán)境下反應(yīng)20 min(盡量避光)；移取50 μL終止液加入反應(yīng)；在波長為450 nm條件下測定樣本的OD值。

1.4.4 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA水平的影響 RAW264.7細(xì)胞按照1.5.1項方法處理后，收集細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過RT-PCR檢測TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA表達(dá)，引物序列如表1所示。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃變性5 min、60 ℃變性30 s、72 ℃延伸20 s條件擴(kuò)增40次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算炎癥因子mRNA水平。

表1 炎癥相關(guān)因子的基因引物序列

1.4.5 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞Sirt 6表達(dá)和NF-κB p65磷酸化水平的影響 RAW264.7細(xì)胞按照1.5.1項方法處理，收集細(xì)胞后采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后，上樣20 μg蛋白，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗p38(1∶1000)、Sirt6 (1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)和NF-κB p65(1∶1000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入二抗(1∶5000)封閉1 h后，采用ECL顯影，以Image J統(tǒng)計灰度值。

1.4.6 計算機(jī)虛擬分子對接檢測Hyp與p38的親和力 采用Autodock 4.2以及AutodockTools軟件進(jìn)行分子虛擬對接，觀察Hyp及p38的親和力情況。從Protein Data Bank (http://www.rcsb.org) 數(shù)據(jù)庫獲取p38蛋白的pdb格式文件，其PDB ID為1ZZL。采用Autodock 4.2分別對Hyp與p38蛋白進(jìn)行分子對接。

1.4.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡變化 將細(xì)胞按照1.4.1描述的方法處理后，收集細(xì)胞加入70%預(yù)冷的乙醇溶液4 ℃條件下孵育過夜后，加入50 mg/ml的碘化丙啶染色液及100 mg/ml RNase A，在室溫條件下避光孵育15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期和凋亡改變。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Hyp對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

圖2示，Hyp(0 μmol/L, 1.563 μmol/L, 3.125 μmol/L, 6.25 μmol/L, 12.5 μmol/L, 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L)單獨處理或與LPS共同作用均對RAW264.7細(xì)胞活力無影響；而Hyp(200 μmol/L, 400 μmol/L)單獨處理或與LPS共同作用均明顯抑制細(xì)胞活力；表2、3示，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，與MTT研究結(jié)果一致，表明Hyp在濃度100 μmol/L以下為其安全范圍(P<0.05)。

注：不同濃度Hyp作用24 h后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力。 A.正常對照組；B. LPS組；C. Hyp (25 μmol/L)；D. Hyp (50 μmol/L)；E. Hyp (100 μmol/L)；F. 地塞米松(放大400×)

表2 Hyp對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.2 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

表4示，LPS(1 μg/ml)刺激RAW264.7細(xì)胞后，NO、TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量較正常對照組明顯升高。Hyp(25、50、100 μmol/L)和陽性藥地塞米松組能夠明顯降低NO、TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量，并呈濃度依賴性(P<0.05)。

表3 Hyp和LPS共同作用對RAW264.7細(xì)胞活力的影響

表4 Hyp對 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的影響

2.3 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA水平的影響

表5示，研究結(jié)果表明，LPS(1 μg/ml)刺激RAW264.7細(xì)胞后，TNF-α、IL-1β、IL-6和 iNOS的mRNA水平較正常對照組明顯升高。Hyp(25、50、100 μmol/L)和陽性藥地塞米松組能夠顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-6和 iNOS的mRNA水平，并呈濃度依賴性(P<0.05)。

表5 Hyp對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA水平的影響

2.4 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞Sirt 6表達(dá)和NF-κB p65磷酸化水平的影響

圖3表6示，LPS明顯增加p-NF-κB p65水平，降低Sirt6的蛋白表達(dá)。而Hyp顯著降低p-NF-κB p65水平，增加Sirt6的蛋白表達(dá)(P<0.05)。

表6 Hyp對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞Sirt 6表達(dá)與NF-κB p65磷酸化水平的影響量化比較

注：1：正常對照組；2. LPS組；3. Hyp (25 μmol/L)；4. Hyp (50 μmol/L)；5. Hyp (100 μmol/L)；6. 地塞米松

2.5 Hyp結(jié)合并抑制p38蛋白

圖4示，采用模擬分子對接方法評價Hyp與p38蛋白結(jié)合情況的對接結(jié)果顯示，Hyp能夠與p38結(jié)合，兩者的結(jié)合能為-6.05 kcal/mol。Hyp與p38蛋白對接具有豐富的氨基酸殘基，主要包括Asp168、Lys53、His107、Tyr35、Leu167等，提示Hyp可能直接作用于p38發(fā)揮抗炎作用。

注：A.Hyp與p38結(jié)合表面的可視化結(jié)果；B-C.Hyp與p38結(jié)合位點的可視化結(jié)果；D.Hyp與p38對接的氨基酸殘基位點可視化結(jié)果

2.6 Hyp對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞周期和凋亡的影響

圖5示，與空白組比較，LPS明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡，且S期細(xì)胞顯著增加；與模型組比較，Hyp可顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡，且S期細(xì)胞明顯減少，提示Hyp能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡。

注：A.正常對照組；B. LPS組；C. Hyp (25 μmol/L)；D. Hyp(50 μmol/L)；E. Hyp (100 μmol/L)；F. 地塞米松

3 討論

巨噬細(xì)胞是參與炎癥反應(yīng)的重要免疫細(xì)胞，在外界因素(如LPS)刺激的情況下可產(chǎn)生炎癥因子[10-11]。LPS為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子(如NO、TNF-α等)[12-13]。其中，NO廣泛存在于生物體內(nèi)，過度的炎癥反應(yīng)可產(chǎn)生iNOS，進(jìn)而合成大量NO而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。TNF-α、IL-1β、IL-6為炎癥反應(yīng)中的主要炎癥因子，是反應(yīng)炎癥水平的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，LPS明顯增加RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1β、IL-6釋放量，與文獻(xiàn)報道一致[14]。而山楂葉提取物Hyp能夠明顯減少RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1β、IL-6釋放量，表明山楂葉提取物Hyp具有明顯的抗炎作用，但其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，p38 MAPK是其家族重要成員之一。據(jù)文獻(xiàn)報道，p38 MAPK在炎癥刺激下被磷酸化后激活其下游基因NF-κB發(fā)揮作用[15]。NF-κB是炎癥反應(yīng)過程中重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其家族成員主要包括p65和p50。正常生理情況下，NF-κB(p50/p65)以異二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；在炎癥(如LPS)刺激條件下，NF-κB信號通路被激活后NF-κB-p65由細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、IL-6 、IL-1β、iNOS等炎性因子的釋放。本研究結(jié)果顯示，LPS能夠通過磷酸化使磷酸化p38 MAPK，繼而激活其下游的NF-κB p65，進(jìn)而上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA水平，與文獻(xiàn)報道一致[16]。而山楂葉提取物Hyp能夠明顯抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平，并顯著下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA水平。沉默信息調(diào)節(jié)因子6(silent information regulator 6，Sirt 6)是SIR2家族的重要成員之一。最近文獻(xiàn)報道，Sirt 6不僅具有抗氧化作用，還可調(diào)控NF-信號轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放[17]。本研究結(jié)果顯示，LPS能夠明顯降低Sirt6的蛋白表達(dá)，與文獻(xiàn)報道一致[18]。而山楂葉提取物Hyp可明顯增加Sirt6的蛋白表達(dá)，提示山楂葉提取物Hyp可以通過抑制p38 MAPK磷酸化，激活Sirt6進(jìn)而調(diào)控NF-κB炎癥通路發(fā)揮作用。值得注意的是，分子對接結(jié)果表明，山楂葉提取物Hyp能夠與p38 MAPK結(jié)合并通過氨基酸殘基Asp168、Lys53、His107等發(fā)生相互作用，提示p38 MAPK可能為山楂葉提取物Hyp作用的潛在靶點。值得注意的是，Hyp能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并使其阻滯在S期，但其抗凋亡的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。此外，本研究只是初步探討了在體外實驗中Hyp的抗炎作用可能與抑制p38 MAPK磷酸化和激活Sirt6進(jìn)而抑制NF-κB p65的磷酸化，從而抑制炎癥因子的釋放有關(guān)，其具體的作用機(jī)制還有待于在體內(nèi)動物實驗中進(jìn)一步驗證。

綜上，在本實驗條件下，Hyp具有抗LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，其作用可能與調(diào)控p38 MAPK/Sirt6/NF-κB信號通路相關(guān)。本研究旨在為將Hyp研發(fā)為抗炎藥物應(yīng)用于臨床治療炎癥相關(guān)疾病提供重要參考。