梁 媛， 苗 襄， 高靜靜， 岳廣欣△， 岳利峰

(1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700；2.莆田市中醫(yī)醫(yī)院，福建 莆田 351100；3.開封市中醫(yī)院，河南 開封 475000；4.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院， 北京 100700)

早年不良應激屬于慢性心理應激(chronic psychological stress，CPS)的一種，兒童時期受到創(chuàng)傷、虐待和忽視的經(jīng)歷與其成年后罹患精神疾患的風險增加密切相關(guān)，且已被證明會導致嚙齒類、靈長類動物和人類的各種行為缺陷[1-2]。母嬰分離動物模型是早年應激對個體生理、病理造成不良影響的神經(jīng)生物學機制研究的重要工具。前期工作發(fā)現(xiàn)，母嬰分離小鼠成年后更容易表現(xiàn)出抑郁、焦慮樣行為，如在高架十字迷宮實驗開放臂活動減少、強迫游泳與鼠尾懸掛實驗中不動時間明顯延長等[3-6]，但其具體的作用機制尚不清楚。近年來研究提示，炎癥免疫反應參與其中[7]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細胞，隨著對其功能研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，其在精神障礙類疾患的發(fā)病中起著越來越重要作用[8-9]。

白芍( Radix Paeonia Alba) 為毛莨科植物芍藥(Paeonialactiflora Pall．)的干燥根，性微寒，味苦酸，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血斂陰、平抑肝陽、柔肝止痛之功[10]。其有效成分主要是一組苷類，包括芍藥苷、白芍苷 R1、芍藥新苷、氧化芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等，總稱為白芍總苷(total glycosides of paeony ,TGP)[11-12]，并具有補血、降壓、抗炎、鎮(zhèn)痛等多重藥理作用[13-15]。近期有學者發(fā)現(xiàn)，TGP在慢性應激小鼠模型中能夠發(fā)揮一定的抗抑郁作用[16]。本實驗建立母嬰分離模型小鼠，在其生長至P90～P120時以TGP進行4周的干預，通過曠場及社會交互行為實驗觀察4周后小鼠行為模式的變化，免疫組織化學方法檢測小膠質(zhì)細胞標志物離子鈣接頭蛋白 (ionized calcium-binding adaptor molecule，Iba) -1的表達，研究TGP對小膠質(zhì)細胞功能狀態(tài)的影響，以期進一步探討TGP的免疫與抗炎作用及其對早年心理應激造成成年后抑郁易感性的可能作用機制。本研究已通過中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物倫理委員會批準，批準號2019-003。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級C57BL/6J小鼠60只，雌鼠48只，雄鼠12只，體質(zhì)量19～26 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0012，置于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物房常規(guī)飼養(yǎng)，室溫22 ℃，相對濕度30%～40%，12 h光/暗周期，自由進食和飲水。

1.2 主要藥物與試劑

白芍總苷膠囊(規(guī)格0.3 g×36粒，批號160803)，朗生醫(yī)藥有限公司；包埋劑(ZLI-9302)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TritonX-100(H5142)，Promega；正常兔血清(ZLI-9026)、抗體稀釋液(2LI-9029)、兔抗山羊lgG/生物素標記(ZB-2050)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Anti-Iba-1antibody(ab5076；abcam)、Elite ABC試劑盒(PK-6100，VECTASTAIN)、DAB(D5637-5G)，sigma公司。

1.3 母嬰分離

選用24 g 以上成年C57BL/6J小鼠進行繁殖，將小鼠按雌雄=4∶1雌雄混居，孕鼠待產(chǎn)前單籠飼養(yǎng)，分娩后每窩仔鼠保持在4～7 只，以小鼠出生作為0 天(P0)，分別于P5～P14 進行母嬰分離，即先將母鼠移至新籠，再將仔鼠移至孵育箱(32 ℃)，每只仔鼠放在獨立的小盒中進行分離，每天分離8 h。

1.4 動物分組及給藥

選用出生后P90～P120的 C57BL/6J雄性小鼠進入實驗。先將未經(jīng)過母嬰分離且月齡相當?shù)?0只小鼠作為正常組，再將經(jīng)過母嬰分離的10只小鼠分成母嬰分離組和TGP組8只。參照說明書，TGP的用藥量按0.5 mg/10 g體質(zhì)量計算。每粒膠囊重0.3 g，含104 mg TGP活性成分，1只實驗鼠(20 g)1d的用藥量為1.0 mg，8只小鼠28 d總用藥量224 mg，換算成TGP膠囊即為646 mg。將646 mg TGP膠囊溶于雙蒸水中定容至896 ml，按每只小鼠日采食量4 g計算，將896 g粉碎飼料與上述藥水混合均勻(藥水與飼料=1∶1)。將混合好的飼料用簡易面條機壓縮成條狀，在烤箱中烘烤8 h，干燥冷卻后含藥飼料即準備就緒。為防止灌胃造成的應激與損耗，TGP組小鼠每天給予一定量的TGP含藥飼料進行干預，共喂養(yǎng)28 d。正常組和母嬰分離組在此期間分別喂飼正常飼料。

1.5 行為學檢測

行為學檢測均在藥物干預4周后開始，具體操作如下。

1.5.1 曠場實驗 小鼠適應實驗室15 min后，放入曠場箱(40 cm×40 cm)中心點，設(shè)中心點附近20×20 cm區(qū)域為中央?yún)^(qū)，記錄30 min小鼠運動總路程(total distance of movement)和中心區(qū)活動時間(central area activity time)。

1.5.2 社會交互實驗 曠場實驗結(jié)束后第2天進行社會交互實驗步驟如下[17]：①實驗鼠放于與原籠一樣的鼠籠中適應15 min，實驗開始前先將1只同種屬同性別的小鼠放置在6×8×10 cm 的金屬網(wǎng)籠中，再將金屬網(wǎng)籠貼壁放在40×40 cm 的曠場箱的一側(cè)箱壁正中，隨即將實驗鼠放至曠場箱的對側(cè)箱壁中點，將金屬網(wǎng)籠周圍25×20 cm區(qū)域設(shè)置為接觸區(qū)，接觸區(qū)對側(cè)的2個13 cm×13 cm角落為遠角區(qū)，記錄5 min 內(nèi)實驗鼠進入接觸區(qū)的時間；②間隔35 min 后，再將實驗鼠放入同樣的曠場箱中，接觸同一只同性別的接觸鼠，再次記錄測試實驗鼠進入接觸區(qū)的時間；③進入遠角區(qū)時間為遠角停留時間(distant residence time)，第1 次測試進入接觸區(qū)時間為訓練探查時間(training exploration time),第2 次測試進入接觸區(qū)時間為辨別探查時間(discrimination exploration time)。

1.6 免疫組化染色

行為學實驗結(jié)束后，各組小鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射進行深度麻醉(100 mg/kg體質(zhì)量)，繼之用4%多聚甲醛溶液灌注，取腦后固定12 h(4 ℃保存)，置于30%蔗糖溶液中脫水(4 ℃保存)，待組織下沉后恒冷低溫切片(30 μm)。切片置于24孔板中平衡30 min，通過漂浮法進行免疫組化染色，用抗體稀釋液稀釋一抗(Iba-1稀釋度為1∶1000)，4 ℃孵育18 h；生物素化的二抗(1∶250)室溫搖床孵育4 h；Elite ABC(1:25，用1×PBS稀釋)，室溫搖床90 min；0.05%DAB顯色，以上步驟皆用1×PBS充分漂洗，將切片貼于載玻片上，干燥后脫水、透明、封片、拍攝。選用每組冠狀面相似并帶有海馬的切片，利用AperioCS2數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)掃描腦組織切片，用Image Scope在20×放大倍數(shù)下截取CA1區(qū)、CA3區(qū)、下丘腦圖像，圖像大小為1264×697，每組20張切片，利用image pro Plus 6分析并計算陽性產(chǎn)物的IOD值。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 曠場實驗結(jié)果

圖1示，與正常組比較，母嬰分離組小鼠30 min運動總距離明顯增加 (P<0.05) ，TGP可明顯縮短小鼠的運動總距離(P<0.05)，3組小鼠中心區(qū)停留時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：A：曠場實驗(Open field test)中心區(qū)停留時間(time in center zone)，B：曠場實驗30 min運動總距離(total distance in 30 min)；結(jié)果以表示；NC:對照組，n=10；MS:母嬰分離組，n=10；TGP:TGP治療組，n=8。與NC組比較:*P<0.05；與MS組比較:##P<0.01

2.2 社會交互實驗結(jié)果

圖2示，與正常組比較，母嬰分離組小鼠的訓練探查時間增加，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，辨別探查時間明顯增加且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；白芍總苷組可明顯縮短母嬰分離小鼠的訓練探查時間(P<0.05)和辨別探查時間(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。2次試驗中，3組小鼠之間的遠角停留時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：社會交互實驗(social interaction test)A：訓練探查時間(training exploration time)，B：辨別探查時間(discrimination exploration time)，C：第1次遠角停留時間(distant residence time in training trial)，D：第2次遠角停留時間(distant residence time in adaptation trial)；結(jié)果以表示；NC:對照組，n=10；MS:母嬰分離組，n=10；TGP:TGP治療組，n=8。與NC組比較:*P<0.05;與MS組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.3 免疫組化實驗結(jié)果

圖3、4與圖5示，與正常組比較，母嬰分離組小鼠的Iba-1陽性表達產(chǎn)物IOD值在海馬CA1區(qū)、海馬CA3區(qū)及下丘腦均顯著增加(P<0.01)，且母嬰分離組小鼠小膠質(zhì)細胞胞體明顯變大，突起回縮；TGP組與母嬰分離組比較，Iba-1陽性表達IOD值均顯著降低(P<0.01)，且胞體明顯變小，差異有統(tǒng)計學意義。

注：NC：對照組，n=6；MS：母嬰分離組，n=6；TGP：TGP治療組，n=6。A-F為免疫組化染色圖：(A和B)NC組，(C和D)MS組，(E和F)TGP組；A、 C和E，放大倍數(shù)×20，比例尺，500 μm；B、D和F：放大倍數(shù)×100，比例尺，200 μm；B、D和F中的箭頭表示Iba-1陽性細胞；(G)各組大鼠海馬CA1區(qū)Iba-1的IOD值；與NC組比較：**P<0.01，與MS組比較：##P<0.01

注：NC：對照組，n=6；MS：母嬰分離組，n=6；TGP：TGP治療組，n=6。HM為免疫組化染色圖：(H和I)NC組，(J和K)MS組，(L和M)TGP組；H、J和L，放大倍數(shù)×20，比例尺，500 μm；I、K和M：放大倍數(shù)×100，比例尺，200 μm；I、K和M中的箭頭表示Iba-1陽性細胞；(N)各組大鼠海馬CA3區(qū)Iba-1的IOD值；與NC組比較：**P<0.01，與MS組比較：##P<0.01

注：NC：對照組，n=6；MS：母嬰分離組，n=6；TGP：TGP治療組，n=6。OT為免疫組化染色圖：(O和P)NC組，(Q和R)MS組，(S和T)TGP組；O、Q和S，放大倍數(shù)x20，比例尺，500 μm；P、R和T：放大倍數(shù)×100，比例尺，200μm；P、R和T中的箭頭表示Iba-1陽性細胞；(N)各組大鼠海馬下丘腦區(qū)Iba-1的IOD值；與NC組比較：**P<0.01，與MS組比較：##P<0.01

3 討論

TGP是從芍藥根中提取的有效成分，能夠減輕多種疾病的免疫反應[18]。本研究結(jié)果顯示，口服TGP能夠有效調(diào)節(jié)母嬰分離模型小鼠的行為并改善其相關(guān)腦區(qū)的小膠質(zhì)細胞活化。

在30 min的曠場實驗中，MS(8 h)小鼠與正常組小鼠相比運動總距離增加，提示動物處于多動與焦慮的狀態(tài)。社會交互實驗中，MS小鼠在第1次和第2次接觸未知個體時都表現(xiàn)出比對照組更長的探索時間。據(jù)此推斷當MS小鼠長大后，早期母嬰分離可能改變其在陌生環(huán)境中的行為反應，使其在未知區(qū)域與陌生個體接觸時無法正確評估環(huán)境并及時規(guī)避可能的風險。同時也意味著，MS小鼠成年后在一定程度上出現(xiàn)認知能力的下降，這是抑郁癥的潛在癥狀之一。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長期與反復的MS會增加小鼠的焦慮樣行為，并提高其成年后的抑郁易感性。有研究顯示，MS(3 h)可使女性的社交能力增強，而男性則完全不受影響，輕度的早年應激可能對個體的后期行為反應有積極的影響，甚至能夠使其在面對強烈的壓力時更容易適應[19-20]。但長期MS(超過4 h)能造成嚙齒類動物下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸顯著失調(diào)，增加其焦慮、抑郁樣行為。這與本課題組的研究結(jié)果一致[21]。本次研究發(fā)現(xiàn)，TGP對曠場與社會交互實驗中模型小鼠異常的行為學變化起到了顯著的干預作用。

為探討MS引起行為學改變的生物學機制，本研究通過免疫組化方法檢測了小鼠海馬和下丘腦小膠質(zhì)細胞標志物Iba-1的表達。小膠質(zhì)細胞是唯一存在于大腦中的免疫細胞，它對外界或內(nèi)部的刺激非常敏感，任何可能破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的微小刺激都會引起小膠質(zhì)細胞的激活。這種激活可表現(xiàn)為細胞形態(tài)及功能狀態(tài)2個方面，活化后的小膠質(zhì)細胞在細胞形態(tài)上表現(xiàn)為胞體增大、凸起回縮[22]，由分枝樣的靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變成阿米巴蟲樣的活化狀態(tài)[23]；功能狀態(tài)方面，小膠質(zhì)細胞被迅速活化后開始吞噬與清除凋亡、壞死和受損的神經(jīng)元[24-25]，從而抑制炎癥發(fā)展，但過度的吞噬作用和免疫反應會使小膠質(zhì)細胞活化過度，進而釋放出大量的炎性因子、細胞毒性物質(zhì)等多種介質(zhì)，從而加重炎癥反應[26-27]。由小膠質(zhì)細胞過度激活而導致的神經(jīng)炎癥是引起認知能力下降和神經(jīng)元突觸功能異常的最直接原因，而認知能力下降是抑郁癥的典型癥狀。多項研究證實，抑郁癥患者常出現(xiàn)海馬區(qū)體積縮小、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸功能異常等表現(xiàn)[28]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MS小鼠的海馬和下丘腦區(qū)域小膠質(zhì)細胞的胞體明顯增大，陽性產(chǎn)物的數(shù)量與密度明顯增加，表明小膠質(zhì)細胞已被激活。TGP對激活的小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在臨床上TGP已被廣泛應用于RA和SLE的治療[29]。多項實驗研究表明，TGP具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，動物實驗發(fā)現(xiàn)，TGP可以呈劑量依賴性地對抗皮質(zhì)酮誘導的神經(jīng)毒性[30]。有學者發(fā)現(xiàn)，TGP在HPA軸失調(diào)的大鼠中表現(xiàn)出抗抑郁的作用[31]。本研究表明，TGP降低了母嬰分離小鼠海馬和下丘腦腦區(qū)小膠質(zhì)細胞的表達，提示TGP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進而對其成年后抑郁易感性產(chǎn)生一定的影響。

TGP是中藥白芍的主要有效成分?！侗静菥V目》有云：“白芍藥益脾，能于土中瀉木。”數(shù)據(jù)挖掘研究發(fā)現(xiàn)，白芍→當歸及白芍→甘草藥對是治療抑郁方劑的基本藥對，在抑郁癥治療中具有舉足輕重的地位，也是具有疏肝健脾功效的中藥名方逍遙散的重要組成部分[32]。大量臨床與實驗研究都發(fā)現(xiàn)，逍遙散具有較好的抗抑郁效果，其抗抑郁的藥理成分主要包括芍藥苷和柴胡皂苷等[33]。本研究對TGP的分子機制進行了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)其對抗免疫激活的作用可能是其干預MS小鼠成年后抑郁易感性的可能機制之一，這在一定程度上證實炎癥與抑郁的密切關(guān)系，與中藥能通過多靶點、多途徑發(fā)揮綜合效應的作用特點?？傊?，TGP可能成為治療抑郁癥的潛在藥物，今后課題組將繼續(xù)進行相關(guān)研究。