姜 楠， 薛 欣， 張媛媛， 陳 晨， 曾 輝， 馬雅鑾△

(1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所， 北京 100700； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所， 北京 100015； 3.新發(fā)突發(fā)傳染病研究北京市重點實驗室， 北京 100015)

2019年《從我國心血管病流行趨勢看膽固醇的干預策略》指出，2012年我國18歲以上人群血脂異?；疾÷矢哌_40.4%，且近年來一直呈現(xiàn)上升趨勢[1]。高脂血癥與長期高脂飲食、肝臟負擔加重、脂代謝障礙有關(guān)，可導致非酒精性脂肪性肝病(non-alcholic fatty liver disease，NAFLD) 和動脈粥樣硬化( atherosclerosis，AS)發(fā)生[2-3]。

課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可導致載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene knockout，apoE-/-)小鼠NAFLD和AS[4-5]，黃連解毒湯干預可減輕NAFLD和AS病變[5-6]，主要機制與黃連解毒湯降低單核細胞比例、減輕高脂造成的粒細胞活化、增加肝臟替代活化型M2巨噬細胞有關(guān)，且黃連解毒湯的這些作用獨立于降脂作用[5-7]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可導致腸道菌群失衡、菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。菌群失衡不僅擾亂機體膽固醇代謝，還會激活機體免疫引發(fā)炎癥反應，加速高脂血癥、NAFLD和AS[8]。在本研究中，探討黃連解毒湯能否改善apoE-/-小鼠腸道菌群失衡，進一步揭示黃連解毒湯調(diào)節(jié)NAFLD和AS的作用機制。本研究符合中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所實驗動物福利倫理審查委員會標準，動物實驗倫理審查編號2018-071。

1 材料與方法

1.1 動物

8周齡雌性C57BL/6及apoE-/-小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，動物合格證號1100111911050036。實驗用鼠購自北京大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(京)2016-0010，實驗用鼠飼養(yǎng)于北京大學實驗動物中心SPF動物房，采用標準飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室內(nèi)溫度( 22±2) ℃，室內(nèi)濕度(45±5)%，光照時間為12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥物

黃連解毒湯組成：黃連9 g，黃芩6 g，黃柏6 g，梔子9 g，購自北京同仁堂藥店(藥物批號黃連20140208，黃芩20140111，黃柏109213101，梔子13121901)按煎煮取汁，濃縮成相當于0.5 g/mL生藥含量；阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司，20 mg/片，批號為S36972。

1.3 試劑及儀器

膽固醇(cholesterol，TC，批號CH0101152)、甘油三酯(triglyceride，TG，批號CH0101151)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL，批號CH0101161)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL，批號CH0101162)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT，批號CH0101201)和天冬門氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST，批號CH0101202)試劑盒，四川Maccura公司；單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)檢測試劑盒(批號A034-1-1)，南京建成公司；QIAampDNA Stool Mini Kit試劑盒(批號Qiagen51504)，德國QIAGEN公司；Q5超保真DNA聚合酶(批號#M0494X)，美國New England Biolabs公司；MiSeq Reagent Kit v2(批號MS-103-1003)，美國Illumina公司；Kapa文庫定量試劑盒(批號KK4824),瑞士Roche公司。

Beckman CX4全自動生化分析儀(美國貝克曼·庫爾特公司)；GENESYS 10 S Vis 紫外可見分光光度計(美國Thermo公司)；伯樂T100型梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Illumina Miseq 測序儀(美國Illumina公司)。

1.4 動物分組及干預方法

實驗分5組各10只小鼠。C57BL/6普通飲食(C57BL/6+CD)為對照組；apoE-/-小鼠采用配對比較法隨機分為apoE-/-普通飲食(apoE-/-+CD)、高脂飲食(apoE-/-+WD)、高脂飲食，同時給予黃連解毒湯(apoE-/-+WD+HLJDD)或阿托伐他汀(apoE-/-+WD+Atr)。高脂飼料由78.85%基礎飼料、21%脂肪、0.15%膽固醇組成。每周檢測體質(zhì)量變化，干預組小鼠根據(jù)體質(zhì)量每天給予臨床等效劑量(黃連解毒湯[5 g/(kg·d)] 、阿托伐他汀[3 mg/(kg·d)])，其他小組采用等量純凈水灌胃，分別干預4周和18周。

1.5 檢測指標及方法

干預4周后每組取5只小鼠。小鼠異戊烷吸入麻醉，摘眼球采血，EDTA抗凝，離心分裝血漿，用于血脂和單胺氧化酶檢測；處死小鼠取肝臟進行單胺氧化酶檢測，取結(jié)腸內(nèi)容物用于16 S rDNA測序分析。余下小鼠繼續(xù)干預至18周，異戊烷吸入麻醉，取肝臟和胸腹主動脈，用于病理檢測油紅O染色。

1.5.1 血脂和肝功能測定 干預4周小鼠的血漿采用過氧化酶法測定血漿TC，脂肪酶/甘油磷酸酯氧化酶-過氧物酶比色法測定TG，直接法測定HDL、LDL、ALT和AST水平。

1.5.2 結(jié)腸內(nèi)容物菌群檢測 干預4周小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取DNA。采用兩步PCR法，先擴增16 S rDNA V3-V4區(qū)，然后采用帶有序列標簽(Barcode)的接頭引物進行第二次PCR反應，反應產(chǎn)物純化后，采用KAPA文庫定量試劑盒對測序文庫進行精確定量。測序采用Illumina Miseq測序平臺，測序策略為250PE，每個文庫測序量100K reads，測序結(jié)果進行生物信息分析。原始reads采用QIIME軟件進行拼接后，根據(jù)每個文庫的 Barcode 和樣品的index識別樣品，將reads拆分到各個樣品中。利用GreenGenes數(shù)據(jù)庫(http://greengenes.secondgenome.com/)比對高質(zhì)量數(shù)據(jù)，將序列相似度≥97%進行OTU劃分。最后采用R(3.4.3)軟件和Past 3.0軟件，對數(shù)據(jù)進一步進行高級分析和可視化分析，計算樣本α和β多樣性。

1.5.3 MAO檢測 干預4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠的肝臟組織勻漿，提取蛋白測定蛋白濃度。采用MAO檢測試劑盒分別檢測血漿和提取肝組織蛋白的MAO活力。

1.5.4 病理染色 干預18周小鼠的肝臟和胸腹主動脈，用4%多聚甲醛固定，20%蔗糖脫水，肝組織病理切片，肝組織和胸腹主動脈經(jīng)油紅O染色、分化后鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平變化

表1示，與C57BL/6小鼠比較，普通飲食沒有造成apoE-/-小鼠體質(zhì)量明顯變化。apoE-/-小鼠高脂飲食，體質(zhì)量增加(P<0.05)，黃連解毒湯和阿托伐他汀干預體質(zhì)量沒有明顯改善(P>0.05)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平比較

血脂變化與既往研究一致，與C57BL/6小鼠比較，apoE-/-小鼠TC和LDL水平升高，HDL水平降低(P<0.001)；高脂飼喂的apoE-/-小鼠TC和LDL水平進一步升高(P<0.001)。黃連解毒湯干預后，小鼠血脂水平未見明顯改變(P>0.05)。

2.2 各組小鼠肝功能ALT和AST水平變化

表2示，各組小鼠干預4周，肝功能ALT和AST水平無明顯變化。

表2 各組小鼠血漿ALT和AST水平比較

2.3 各組小鼠結(jié)腸菌群變化情況

2.3.1 各組小鼠結(jié)腸菌群的α多樣性變化 圖1示，與C57BL/6小鼠比較，apoE-/-小鼠結(jié)腸菌群α多樣性雖然降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高脂飲食導致apoE-/-小鼠結(jié)腸菌群α多樣性增加(P<0.05)，黃連解毒湯降低結(jié)腸菌群α多樣性(P<0.05)。

注：C57BL/6+CD為 C57BL/6普通飲食；apoE-/-+CD為apoE-/-普通飲食；apoE-/-+WD為apoE-/-高脂飲食；apoE-/-+WD+HLJDD為apoE-/-高脂飲食加黃連解毒湯；apoE-/-+WD+Atr為apoE-/-高脂飲食加阿托伐他汀。與apoE-/-+WD比較：*P<0.05

2.3.2 各組小鼠結(jié)腸菌群的β多樣性變化 圖2示，分析小鼠結(jié)腸菌群門水平差異發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠比較，apoE-/-小鼠結(jié)腸厚壁菌門(Firmicutes)增加，疣微球菌門(Verrucomicrobia)顯著減少，脫鐵桿菌門(Deferribacteres)和藍藻門(Cyanobacteria)減少；高脂飲食進一步導致apoE-/-小鼠結(jié)腸變形菌門(Proteobacteria)增加，擬桿菌門(Bacteroidetes)減少。黃連解毒湯增加擬桿菌門，尤其是顯著增加疣微球菌門，減少結(jié)腸的厚壁菌門和變形菌門；阿托伐他汀進一步增加結(jié)腸的厚壁菌門，減少擬桿菌門，增加脫鐵桿菌門細菌。

注：C57BL/6+CD為 C57BL/6普通飲食；apoE-/-+CD為apoE-/-普通飲食；apoE-/-+WD為apoE-/-高脂飲食；apoE-/-+WD+HLJDD為apoE-/-高脂飲食加黃連解毒湯；apoE-/-+WD+Atr為apoE-/-高脂飲食加阿托伐他汀。Bacteroidetes為擬桿菌門，F(xiàn)irmicutes為結(jié)腸厚壁菌門，Verrucomicrobia為疣微球菌門，Proteobacteria為變形菌門，Deferribacteres為脫鐵桿菌門，Cyanobacteria為藍藻門

2.3.3 各組小鼠結(jié)腸菌群厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)比值的變化 表3示，與C57BL/6小鼠比較，apoE-/-小鼠結(jié)腸厚壁菌門增加(P<0.05)，擬桿菌門減少，厚壁菌門/擬桿菌門(firmicutes/bacteroidetes, F/B)比值增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高脂飼喂apoE-/-小鼠F/B比值進一步增加，黃連解毒湯減少F/B比值。但因組間差異大，各組之間F/B比值差異無統(tǒng)計學意義。

表3 各組小鼠腸道菌群F/B變化比較

2.4 各組小鼠血漿和肝臟單胺氧化酶活力變化

表4示，單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)活性高低能夠間接反映腸道菌群失衡程度[9]。我們發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6小鼠比較，apoE-/-小鼠血漿和肝臟的MAO活力無明顯改變(P>0.05)；高脂飼喂apoE-/-小鼠血漿和肝臟的MAO活力增加(P<0.05)；黃連解毒湯減少血漿和肝臟的MAO活力(P<0.05)。阿托伐他汀減少血漿MAO活力(P<0.05)，但無明顯改變肝臟的MAO活力(P>0.05)。

表4 各組小鼠血漿及肝臟MAO活力變化比較

2.5 各組小鼠肝臟病理改變情況

圖3示，干預18周后，普通飲食的apoE-/-小鼠肝臟油紅O染色呈陽性，高脂飲食導致油紅O染色陽性增強。黃連解毒湯干預明顯減弱油紅O染色程度，肝臟脂肪病變明顯減輕；阿托伐他汀一定程度減弱肝臟油紅O染色。

注：C57BL/6+CD為 C57BL/6普通飲食；apoE-/-+CD為apoE-/-普通飲食；apoE-/-+WD為apoE-/-高脂飲食；apoE-/-+WD+HLJDD為apoE-/-高脂飲食加黃連解毒湯；apoE-/-+WD+Atr為apoE-/-高脂飲食加阿托伐他汀

2.6 各組小鼠主動脈斑塊形成情況

圖4示，干預18周后，胸腹主動脈血管油紅O染色可見，高脂飲食導致apoE-/-小鼠主動脈胸腹血管斑塊AS病變程度嚴重；黃連解毒湯干預后，主動脈斑塊AS病變程度減輕；阿托伐他汀一定程度減輕主動脈斑塊AS病變。

注：C57BL/6+CD為 C57BL/6普通飲食；apoE-/-+CD為apoE-/-普通飲食；apoE-/-+WD為apoE-/-高脂飲食；apoE-/-+WD+HLJDD為apoE-/-高脂飲食加黃連解毒湯；apoE-/-+WD+Atr為apoE-/-高脂飲食加阿托伐他汀

3 討論

腸道菌群失衡是NAFLD和AS獨立的危險因素之一[10-11]。高脂飲食不僅導致血脂水平升高，并且由于大量的脂肪在腸道被消化吸收，引發(fā)腸道膽汁酸成分和含量的改變，影響細菌生存的環(huán)境，導致腸道菌群失衡[8,12]。失衡的腸道菌群反過來影響機體膽固醇代謝和免疫，加速高脂血癥、NAFLD和AS的進展[8,10-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引發(fā)的腸道菌群失衡有兩個特征：一方面導致apoE-/-小鼠腸道厚壁菌門和變形菌門等條件致病菌豐度增加，厚壁菌門/擬桿菌門比升高[13]；另一方面，擬桿菌門和疣微球菌門等益生菌減少或消失。已有研究表明，厚壁菌門的李斯特菌、葡萄球菌、鏈球菌，以及變形菌門的大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等條件致病菌與肥胖、炎癥和AS相關(guān)[13-15]。而擬桿菌門的擬桿菌和疣微球菌門的艾克曼菌等益生菌與炎癥和代謝紊亂負相關(guān)，可防治肥胖、糖尿病和AS[13,16-18]。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，普通飲食apoE-/-小鼠結(jié)腸菌群α多樣性差異無統(tǒng)計學意義，高脂飼喂后α多樣性增高，說明apoE基因缺失導致的高脂血癥對于腸道菌群影響不大，而高脂飲食則顯著增加了腸道菌群多樣性，提示高脂飲食對于腸道菌群的影響及其重要作用。

進一步的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失衡影響機體膽固醇代謝[8,11]。菌群失衡導致分解膽堿生成三甲胺(trimethylamine，TMA)增多，TMA誘導MAO，MAO的活力可以間接反映腸道菌群失衡的程度[9]。MAO進一步氧化TMA生成氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)，TMAO與NAFLD正相關(guān)[20]，而且抑制膽固醇逆向轉(zhuǎn)運和促進膽固醇流入巨噬細胞，促進AS發(fā)生[8,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與腸道菌群變化一致，高脂喂飼增加了apoE-/-小鼠血漿和肝臟的MAO活力，而普通飲食apoE-/-小鼠MAO的活力沒有明顯改變。這一結(jié)果將高脂飲食導致的菌群失調(diào)，與高脂飲食加重apoE-/-小鼠肝臟損傷和AS進展進一步聯(lián)系起來。

本課題組既往研究已證實，高脂飲食可以造成免疫損傷和炎癥反應，黃連解毒湯能夠糾正高脂飲食導致apoE-/-小鼠的免疫過度活化，降低單核細胞及其表面Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)的表達，增加肝臟M2巨噬細胞比例，抑制炎性因子表達等，減輕全身、血管和肝臟局部炎癥反應[5-7]。本研究進一步證實，黃連解毒湯干預降低高脂引發(fā)的結(jié)腸菌群α的多樣性，減少條件致病菌，增加益生菌，改善高脂引發(fā)的apoE-/-小鼠菌群失衡，降低高脂導致apoE-/-小鼠肝臟和血漿單胺氧化酶活力。雖然本研究未證明腸道菌群與炎癥變化的直接關(guān)系，但已有大量研究表明，菌群失衡促進炎癥反應和免疫損傷。如革蘭陰性桿菌釋放出的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可誘導免疫細胞TLR4表達；革蘭氏陽性細菌肽聚糖增強免疫反應，促進NAFLD和AS的形成[8,20-21]。在本研究干預的4周和18周范圍內(nèi)(結(jié)果未顯示)，黃連解毒湯對于血脂的影響差異無統(tǒng)計學意義，但黃連解毒湯通過改善長期持續(xù)高脂引發(fā)的菌群失衡和后續(xù)的免疫損傷作用于全身和局部(肝臟和主動脈)，因而抑制高脂血癥向NAFLD和AS發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯干預可以調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，降低MAO活性，抑制NAFLD和AS斑塊的形成。課題組一系列的研究表明，黃連解毒湯對于炎性免疫反應及腸道菌群的影響，揭示了黃連解毒湯的多靶點治療機制[5-7,22-23]。課題組今后還將進一步開展和深入相關(guān)研究，有望推動中醫(yī)藥在NAFLD和AS等代謝性疾病的應用。