宋文婷， 苗 蘭， 孫明謙， 曹 慧， 史 躍， 馬彥雷， 李 磊， 馬京泉， 劉建勛△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100091；2.北京市中藥藥理重點實驗室， 北京 100091)

氣血理論是中醫(yī)學(xué)的基本理論之一，其核心在于“氣血相關(guān)，相互為用”，即“氣為血之帥，血為氣之母”。在不同的疾病和疾病的各個階段，氣與血的不平衡導(dǎo)致各不相同的癥狀與證候。氣虛會導(dǎo)致血的運行不暢，而血瘀反過來又加重氣虛，兩者互相影響，纏綿難愈。中風(fēng)病(腦梗死)是中醫(yī)學(xué)四大頑疾之首，經(jīng)學(xué)者統(tǒng)計，中風(fēng)辨證過程中氣虛血瘀是缺血性中風(fēng)的重要病機(jī)之一[1],臨床常表現(xiàn)為半身不遂、氣短乏力、脈沉細(xì)等[2]。

清代醫(yī)家王清任認(rèn)為，中風(fēng)病人體內(nèi)“血賴元氣運行，元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”“虧損五成元氣”，遵循“虛則補(bǔ)之”治則，創(chuàng)補(bǔ)陽還五湯以益氣活血[3]。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁組成，是益氣活血法的代表性經(jīng)典名方，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效。益氣活血法治療中風(fēng)之氣虛血瘀證，具有良好的臨床療效。

本課題組使用的益氣通絡(luò)顆粒是補(bǔ)陽還五湯的加減方，在臨床中應(yīng)用于治療缺血性心腦血管病，癥見氣虛血瘀者療效顯著[4-5]。近年來，在腦缺血復(fù)合氣虛血瘀證的動物模型方面，顯示出較為滿意的藥效[6]，且學(xué)者們還從大鼠血管新生[6]和內(nèi)皮功能[7]等方面闡釋了益氣活血方的藥理機(jī)制，但尚未見益氣活血方的拆方研究。因此本實驗從益氣活血兩方面來研究益氣活血顆粒中益氣藥與活血藥的功效，并初步考察這兩類藥物對于氣虛血瘀型腦缺血模型大鼠的恢復(fù)是否具有協(xié)同作用。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會審批通過，編號2018XLC003-2。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號 SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 SPF 級實驗動物中心，許可證號 SYXK(京)2015-0011。

1.2 藥物

益氣活血方臨床用藥藥量為19.4 g·d-1，相當(dāng)于生藥143 g·d-1(處方組成為黃芪60 g，赤芍15 g，川芎12 g，當(dāng)歸尾20 g，地龍12 g，紅花12 g，桃仁12 g)，其中黃芪為益氣藥，剩余6藥為活血藥。

華潤三九藥業(yè)提供的黃芪、川芎、赤芍、紅花、桃仁、地龍、當(dāng)歸尾配方顆粒的飲片當(dāng)量分別為10 g·g-1，6 g·g-1，5 g·g-1，6 g·g-1，20 g·g-1，6.7 g·g-1，5 g·g-1，在配藥時先將各個顆粒劑分別進(jìn)行稱量后再混合，以蒸餾水配制成混懸液。大鼠自睡眠剝奪第5天開始給藥，全方組每天給予配方顆粒3.49 g·kg-1，益氣藥組和活血藥組分別給予1.08 g·kg-1和2.408 g·kg-1配方顆粒，2倍臨床等效劑量。各組藥物均以蒸餾水配制成混懸液，每天灌胃給藥，給藥體積為 10 ml·kg-1，空白組和模型組每日給予相應(yīng)體積蒸餾水。

1.3 試劑

熒光微球(UVPMS-BY2)Sigma公司；異氟烷(批號64170902)，魯南貝特制藥有限公司；醫(yī)用水合氯醛(批號Z16J10Y80098)，上海源葉生物有限公司；純凈水，中國娃哈哈有限公司；丙二醛(MDA)測試盒(批號20190410)、大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號20191016)、大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號20191016)、大鼠內(nèi)皮素-1(ET-1)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號20191016)、大鼠血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號20191016)，南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

Mouse Ox 型小動物無創(chuàng)脈搏血氧儀(美國 Starr Life Science Inc公司)；VIP 3000 型小動物麻醉機(jī)(美國Matrx公司)；ES-1100 型電子天平(長沙湘平科技發(fā)展有限公司)；LBY-N6C 型全自動血液流變測定儀(北京普利生儀器有限公司)；睡眠剝奪用水環(huán)境平臺盒(本實驗室自制)；22 R高速離心機(jī)(德國Mikro公司)；低溫冰箱(美國Thermo公司)；VCX 150PB 型勻漿機(jī)(美國Sonics公司)。

1.5 動物造?！邉儕Z復(fù)合多發(fā)性腦梗(MCI)大鼠模型

因本課題采用SD大鼠構(gòu)建氣虛血瘀型腦梗模型，基于本課題組前期對氣虛血瘀證及腦梗死的相關(guān)研究[8-9]，確定采用微球致多發(fā)性腦梗合并水平臺不完全睡眠剝奪法建立病證結(jié)合動物模型，即氣虛血瘀證腦梗死大鼠。將60只雄性健康 SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、睡眠剝奪復(fù)合腦梗組(模型，Model)、益氣活血藥組(YQHX，3.49 g·kg-1)及益氣藥組(YQ，1.08 g·kg-1)、活血藥組(HX，2.408 g·kg-1)5組各12只。先睡眠剝奪2周，然后進(jìn)行微球致多發(fā)性腦梗手術(shù)，術(shù)后復(fù)合睡眠剝奪，并給藥4周。

表1示，睡眠剝奪方法參考文獻(xiàn)[10]中“水環(huán)境小平臺法”，即把大鼠放入水深3.5 cm 的水環(huán)境小平臺盒里，每個盒里有6個小平臺(直徑6 cm，高4 cm)，每盒放5只大鼠，用帶有食槽的鐵絲網(wǎng)蓋住，大鼠不能逃脫但可以自由進(jìn)食飲水，每天睡眠剝奪16～24 h不等。睡眠剝奪結(jié)束后回籠正常飲食飲水。為避免大鼠耐受睡眠剝奪，每天不在同一時間進(jìn)行操作。

表1 睡眠剝奪時間表

多發(fā)性腦梗(MCI)大鼠模型制備：麻醉大鼠頸部正中切口，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。用動脈夾夾閉頸總動脈，頸外動脈的遠(yuǎn)心端用線結(jié)扎，用注射器從頸外動脈向頸內(nèi)動脈注入熒光微球0.1 mL，微球經(jīng)由頸內(nèi)動脈分散至大腦各動脈。假手術(shù)組大鼠則從頸外動脈向頸內(nèi)動脈注入生理鹽水0.1 mL。松開動脈夾將頸外動脈近心端結(jié)扎，逐層縫合傷口回籠正常飼養(yǎng)，術(shù)后24 h 進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分。淘汰死亡、0 分及 4 分大鼠，1～3 分為多發(fā)性腦梗死模型建造成功。

手術(shù)結(jié)束3 d后開始給藥，并恢復(fù)睡眠剝奪操作，每天剝奪16 h，干預(yù)4周后取材。

鄂東古城蘄州鎮(zhèn)東，有一綠林掩映的村舍，名曰油鋪。相傳明末清初朱姓皇族為避清軍殺戮，改名換姓逃難至此安家落戶，屈指算來已歷兩百多個春秋。

1.6 負(fù)重力竭游泳時間

按照參考文獻(xiàn)[12]，在大鼠尾巴根部綁定小鉛錘，質(zhì)量約為大鼠體質(zhì)量的5% ，水深75 cm，使大鼠游泳至全身力竭(鼻頭沉入水下10 s以上)及時撈出，用毛巾擦干大鼠身上的水，回籠正常飲食飲水。

1.7 大鼠脈象分析(脈搏幅度)

給藥后4周，2%異氟烷進(jìn)行持續(xù)氣體麻醉，使用 Mouse Ox 小動物無創(chuàng)脈搏血氧儀對大鼠脈搏幅度進(jìn)行檢測，每次每只記錄10 個有效數(shù)據(jù)并取平均值。

1.8 大鼠血液流變學(xué)分析

麻醉大鼠腹主動脈取血，自制肝素抗凝管(肝素2 mL，生理鹽水稀釋至10 mL，每只試管加入50 μL，揮干待用)抗凝，LBY-N6C血液流變測定儀檢測血液流變學(xué)，選用切變率 5，60，150 s-1，血漿 100 s-1。

1.9 血清中ET-1、Ang-Ⅱ、IL-1β、IL-6、MDA水平檢測

大鼠腹主動脈取血，試管內(nèi)靜置1.5 h，4 ℃預(yù)冷，2500 r/min離心15 min，分離血清凍存在-80 ℃冰箱中。取凍存大鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中ET-1、Ang-Ⅱ、IL-1β、IL-6、MDA水平。

1.10 大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)檢查

將大鼠腦組織經(jīng)固定后修塊，脫水后石蠟包埋、切片(4 μm)制片、HE染色，觀察鏡下大鼠腦組織在缺血再灌注損傷之后神經(jīng)元及微血管病變以及炎性反應(yīng)等情況，并觀察藥物干預(yù)情況。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠負(fù)重力竭游泳時間比較

圖1示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠負(fù)重游泳時間明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組游泳時間均延長，但與活血藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，益氣藥和益氣活血藥組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.2 各組大鼠脈象分析

圖2示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脈搏幅度明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組脈搏幅度均有明顯增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各組大鼠血漿及全血黏度比較

表2示，與假手術(shù)組比較，模型組在各切變率下的全血黏度和血漿黏度均有升高趨勢(P<0.01)；相比模型組，各給藥組全血黏度和血漿黏度均有升高趨勢，其中益氣活血藥和益氣藥對血漿黏度有明顯的抑制作用，活血藥對各切變率下的全血黏度有明顯降低作用(P<0.05)。

表2 各組大鼠血漿及全血粘度分析結(jié)果表

2.4 各組大鼠血清ET-1、Ang-Ⅱ值比較

圖3、4示，與假手術(shù)組比較，模型組ET-1、Ang-Ⅱ值均升高，Ang-Ⅱ無統(tǒng)計學(xué)意義，ET-1有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比模型組，各給藥組ET-1、Ang-Ⅱ值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5 各組大鼠血清IL-6、IL-1β值比較

圖5、6示，與假手術(shù)組比較，模型組IL-6、IL-1β值均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相比模型組，各給藥組IL-1β值均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；各給藥組IL-6值也均降低，其中活血藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：##P<0.01

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：##P<0.01

2.6 各組大鼠血清MDA水平比較

圖7示，與假手術(shù)組比較，模型組MDA水平升高(P<0.05)；相比模型組，各給藥組MDA值也均降低，其中益氣活血組和活血藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.7 各組病理形態(tài)學(xué)觀察

模型組改變最多，依據(jù)結(jié)構(gòu)改變的程度排列順序：模型組>黃芪組>益氣組>活血組>全方組>正常組。

假手術(shù)組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞厚薄均勻，排列如常，未見變性、凋亡和壞死灶。海馬CA區(qū)及其他核團(tuán)組織的神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，層次豐富，排列整齊、均勻，細(xì)胞密集，大小適中，胞核、胞質(zhì)清晰，血管壁正常，無增生及出血現(xiàn)象。模型組結(jié)構(gòu)改變明顯，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元水腫、階段性消失，在海馬CA區(qū)存在炎細(xì)胞淋巴細(xì)胞聚集團(tuán)。皮質(zhì)的外椎體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)椎體細(xì)胞層以及多形細(xì)胞層，均有炎細(xì)胞浸潤，偶見壞死灶。

藥物組中，全方組則最接近正常組，結(jié)構(gòu)變化罕見，神經(jīng)元大小適中突觸完整，未見炎細(xì)胞。拆方組雖然各有不同，但是綜合表現(xiàn)，病理改變多于全方及正常組而少于模型組，其特點是益氣組充血明顯，偶見炎細(xì)胞浸潤；活血組接近于全方組，未見炎細(xì)胞浸潤及明顯的壞死區(qū)域。

注：1.假手術(shù)組；2.模型組；3.益氣組；4.活血組；5.全方組

3 討論

本實驗運用睡眠剝奪法復(fù)合微球致多發(fā)腦梗死造大鼠氣虛血瘀證模型，造模成功且與正常對照組比較差異顯著，符合中醫(yī)臨床“日久則虛”的病因病機(jī)。實驗中運用的水環(huán)境小平臺站立睡眠剝奪，在精神及體力上造成大鼠的雙重消耗，日久導(dǎo)致氣虛，氣虛則無力推動血行，導(dǎo)致氣和血的虧虛與阻滯。從“氣”的角度來看，實驗動物脈搏幅度小、力竭游泳時間短皆表明，實驗動物處于氣虛的狀態(tài)，且益氣活血對氣虛的改善作用明顯優(yōu)于益氣藥，活血藥作用稍弱于益氣藥。從“血”的角度來看，模型組大鼠血液黏度增加，符合相關(guān)文獻(xiàn)報道氣虛血瘀證血液流變學(xué)變化[11]。藥物干預(yù)后，各組血液黏度明顯降低，可有效改善血瘀。綜合來看，益氣活血藥既改善氣虛又對血瘀具有較好的治療作用，對氣虛血瘀的治療作用為3組中最優(yōu)。病理形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果也很好地說明了益氣藥與活血藥配伍后的全方對腦組織結(jié)構(gòu)有較好的保護(hù)，全方組病理改變最少且可見炎癥病灶中細(xì)胞呈恢復(fù)狀態(tài)。

《醫(yī)林改錯》中記載: “元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無力，血液在血管中運行勢必遲緩乃至滯阻”，說明氣虛狀態(tài)下，氣無力推動血液正常運行而導(dǎo)致血瘀?，F(xiàn)代研究表明，氣機(jī)異常可能涉及血液流變學(xué)改變[12]、內(nèi)皮功能損傷及炎癥等多方面損傷[7,13-15]。ET-1是維持血管基礎(chǔ)張力穩(wěn)定的重要因素[16]，Ang-Ⅱ是一類促血管生成因子，可促進(jìn)血管生成而加重血管疾病[17]。研究發(fā)現(xiàn)，ET-1、Ang-Ⅱ與氣虛血瘀證病理生理過程密切相關(guān)[18-19]。在病理情況下，血管過度收縮與ET-1、Ang-Ⅱ水平過高有關(guān)，會形成血管舒張障礙，影響微循環(huán)[20-21]。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠較假手術(shù)組ET-1、Ang-Ⅱ顯著升高，提示其血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能失調(diào)，即氣對血液的管控能力下降，給予益氣藥和全方藥后，兩者的水平有不同程度的降低，趨近正常值，證明益氣藥物能通過調(diào)節(jié)相關(guān)血管因子水平，恢復(fù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能，改善微循環(huán)，且當(dāng)益氣藥配合活血時使用時效果更佳。

內(nèi)皮功能障礙會導(dǎo)致內(nèi)皮介導(dǎo)的血管舒張減弱、血流動力學(xué)紊亂、纖溶能力受損、黏附分子以及炎癥因子、活性氧簇產(chǎn)物、氧化應(yīng)激增加以及細(xì)胞滲透增強(qiáng)[22]，這不僅會造成血瘀還可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的發(fā)生。IL-6、IL-1β是重要的炎癥因子。本實驗結(jié)果顯示，氣虛血瘀證大鼠 IL-6、IL-1β較假手術(shù)組均顯著升高，提示在氣虛血瘀證大鼠模型中存在炎性免疫反應(yīng)。MDA是主要的氧化產(chǎn)物，慢性氧化應(yīng)激會加重炎癥反應(yīng)[23]。本實驗觀察到，模型組實驗動物體內(nèi)出現(xiàn)氧化產(chǎn)物的堆積，說明氣虛血瘀大鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激。炎癥及氧化應(yīng)激是腦缺血后導(dǎo)致腦損傷的2個主要環(huán)節(jié)[24-25]，藥物干預(yù)后，3組實驗動物的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激都得到緩解，益氣藥與活血藥能一定程度清除炎癥因子和氧化產(chǎn)物，但二者配伍使用益氣以助血行，同時活血化瘀改善血液循環(huán)，能顯著降低炎性因子和氧化產(chǎn)物水平，對氣虛血瘀型腦梗發(fā)揮重要的治療作用。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯方中起補(bǔ)氣活血作用的主要藥物是黃芪與紅花[26]。黃芪是1味具有扶正益氣功效的傳統(tǒng)中藥，其含量最高的活性成分是黃芪甲苷。前期研究證明，黃芪甲苷對缺血性損傷的保護(hù)機(jī)制可能為抗炎及恢復(fù)血管內(nèi)皮功能[27-28]。而紅花具有活血化瘀、散濕消腫的作用，其與當(dāng)歸配伍廣泛用于血瘀證，當(dāng)歸中的阿魏酸與紅花中的羥基紅花黃A是活血化瘀的主要活性成分，可調(diào)節(jié)血管與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)[29]。因此，益氣活血方發(fā)揮益氣活血化瘀作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是黃芪甲苷、阿魏酸及羥基紅花黃A。值得注意的是，阿魏酸亦是川芎的活性成分之一，有研究證實川芎口服生物利用度大，因其良好的理化特性易于通過血腦屏障能夠抑制氧化應(yīng)激，同時降低IL-1β及IL-6水平，從而抗腦缺血損傷[30]。這與傳統(tǒng)理論認(rèn)為川芎可上行巔頂、活血行氣相符。以上研究結(jié)果表明，益氣藥與活血藥均能表現(xiàn)抗炎、抗氧化作用。但是通過對復(fù)方的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方配伍不僅可促使藥物發(fā)揮協(xié)同作用，還有可能對方中有效成分的體內(nèi)含量起維持作用，起到促進(jìn)及維持功效的作用[26]，因而出現(xiàn)全方組既優(yōu)于益氣藥組也優(yōu)于活血藥組的實驗結(jié)果。

綜上所述，益氣藥與活血藥對氣虛血瘀有一定的治療作用，但二者配伍使用可顯著改善氣虛、降低血液黏度，通過補(bǔ)氣改善受損的血管內(nèi)皮功能而推動血行，進(jìn)而減輕氣虛血瘀導(dǎo)致的炎癥及氧化應(yīng)激，在多個指標(biāo)上益氣藥與活血藥存在協(xié)同作用，使得全方組既優(yōu)于益氣藥組也優(yōu)于活血藥組。