李衛(wèi)東 顏源均 趙世橋 馮堯 蒲志強 馮飛

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，四川 南充 637000)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由嗜心肌病毒感染心肌形成以心肌嚴重的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細胞損傷為主的心臟疾病。常見病毒為柯薩奇病毒B組(coxsackie virus B，CVB)。病毒性心肌炎多發(fā)生于青少年，大部分病情較輕，能夠痊愈；但有少部分病情較重而導(dǎo)致患者死亡，還有一部分發(fā)展成為擴張型心肌病。研究[1]報道，炎癥反應(yīng)及心肌細胞凋亡是導(dǎo)致病毒性心肌炎早期心肌細胞損傷的主要機制。在病毒性心肌炎炎癥反應(yīng)中，炎癥趨化因子IL-1β、IL-18在其中起到重要作用，IL-1β、IL-18在機體內(nèi)是以無功能的前體形式存在的，NLRP3能夠通過凋亡相關(guān)斑點樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)寡集半胱天冬蛋白酶的前體(procaspase-1)從而激活門冬氨酸特異的胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)，激活的caspase-1能對pro-IL-1β、pro-IL-18進行加工切割，形成成熟的具有功能的IL-1β、IL-18并分泌到細胞外發(fā)揮作用[2]。因此，本研究探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性體在病毒感染早期心肌細胞的作用以及與心肌細胞凋亡之間的關(guān)系，為尋找病毒性心肌炎有效的治療靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和實驗動物 CVB3(Nancy株)購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。出生1～2 d的SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 抗NLRP3、ASC及HRP-結(jié)合次級產(chǎn)物的抗體，檢測IL-β、IL-18、CK-MB、cTnI等的ELISA試劑盒，瓊脂糖購自BOSTER公司，胰蛋白酶購于Hyclone，BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA細胞裂解液、annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，Lipofectamine 2000試劑購于Invitrogen，NLRP3 siRNA購于Santa。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細胞培養(yǎng) 根據(jù)既往的文獻[3]報道采用差速貼壁方法分離培養(yǎng)原代心肌細胞。于無菌條件下迅速獲取出乳鼠心臟，將獲取的心臟組織剪切成1～2 mm3的小塊組織并裝入含有約10 mL 0.1%胰蛋白酶的三角瓶中，反復(fù)消化后加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，以4000 r/min離心約10 min，而后棄去上清液。于殘留的固體中加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中混勻。于37 ℃的含有5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁1.5～2 h，吸出含有未貼壁細胞的培養(yǎng)液,于顯微鏡下計數(shù)完成后調(diào)整濃度為3×105/mL接種于含有5-溴脫氧尿苷(最終濃度為0.1 mol/L，抑制非心肌細胞生長)與10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，顯微鏡下可觀察到85%的細胞為心肌細胞且具有明顯的搏動。

1.2.2 NLRP3基因沉默及CVB3感染心肌細胞模型的建立 設(shè)計NLRP3的小干擾RNA(siRNA)以轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)好的SD大鼠心肌細胞中，具體的siRNA轉(zhuǎn)染操作參照美國Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑盒中推薦的轉(zhuǎn)染步驟，具體步驟如下：轉(zhuǎn)染前利用PBS將培養(yǎng)48 h的原代心臟細胞洗滌2次，以5×103細胞/孔接種于6孔板中。將siRNA溶液與lipofectamin2000溶液混合液1 mL/孔，分別加入細胞培養(yǎng)孔，孵育6 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后完成轉(zhuǎn)染。將CVB3 Nancy株接種在HeLa細胞上并測定50%組織感染率(50% tissue culture infective does，TCID50)，選100 TCID50感染心肌細胞。在心肌細胞NLRP3基因沉默后的第二天加入100 TCID5CVB3病毒液100 μL于37 ℃含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h更換為普通培養(yǎng)液，得到CVB3誘導(dǎo)的心肌炎心肌細胞模型。實驗包含4個組別，分別包括正常對照組、Scrambled-siRNA組、CVB3+Scrambled-siRNA組、CVB3+NLRP3-siRNA組。

1.2.3 ELISA檢測各組IL-1β、IL-18、CK-MB、cTnI的水平 各實驗組心肌細胞處理24 h后，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。以標準品的OD值為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程式，將樣品的OD值帶入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即得樣品實際濃度。

1.2.4 RT-qPCR檢測各組中NLRP3的mRNA表達 嚴格按照RT-qPCR試劑盒說明書進行檢測。NLRP3 的上游引物序列為5′-ACGGCAAGTTCGA AAAAGGC-3′，下游引物序列為 5′-AGACCTCGG CAGAAGCTAGA-3′，擴增產(chǎn)物長度為87 bp；β-actin 的上游引物序列為5′-AGACAGCCGCATCTTCTT GT-3′，下游引物序列為5′-TGATGGCAACAAT GTCCACT-3′，擴增產(chǎn)物長度為142 bp。嚴格按照SYBR?Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)說明書操作，整個過程中在加入ROX后需避光操作，冰上操作。由軟件記錄CT值，計算2-ΔΔCT值作為mRNA的表達水平。

1.2.5 Western blot檢測各組中NLRP3、caspase-1、IL-1β、cleaved caspase 1、cleaved caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-9、Bcl-2、bax的蛋白水平 各實驗組心肌細胞處理24 h后，按照說明書提取各組總蛋白。采用BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測各處理組細胞中的總蛋白量，SDS-PAGE凝膠電泳(每孔上樣100 μg)，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入抗NLRP3、caspase-1、IL-1β、cleaved caspase-1、cleaved caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-9、Bcl-2、bax抗體稀釋液(1∶400)、GAPDH內(nèi)參稀釋液(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，第二天加入封閉液稀釋的Ⅱ抗(1∶4000)。充分漂洗后以ECL法顯像，將膜放入曝光儀中曝光，根據(jù)條帶顯色的強弱選擇曝光時間，Image J軟件統(tǒng)計各圖灰度值，計算蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 CVB3病毒感染心肌細胞中NLRP3基因及蛋白表達情況以及NLRP3基因沉默 RT-qPCR實驗結(jié)果表明，CVB3感染后NLRP3的mRNA表達量明顯升高在第12 h達到高峰，后其表達量稍有下降并趨于穩(wěn)定，隨著培養(yǎng)時間的延長其表達量逐漸降低(圖1A)。Western blot檢測結(jié)果表明，CVB3感染后NLRP3的蛋白表達量明顯升高且24 h達到高峰，隨后開始降低，這與NLRP3的mRNA升高基本一致(圖1B)。在敲減NLRP3基因表達后，CVB3感染心肌細胞后RT-qPCR及Western blot檢測結(jié)果表明，敲減NLRP3基因的表達可以明顯降低病毒感染心肌細胞中NLRP3基因及蛋白的表達(P<0.05)(圖1C、D)，表明用基因沉默技術(shù)敲減NLRP3表達是成功的。

圖1 CVB3病毒感染心肌細胞NLRP3基因及蛋白表達的情況

2.2 敲減NLRP3基因的表達可一定程度減輕心肌細胞損傷 ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中心肌損傷標志物CK-MB、cTnI結(jié)果表明，與正常對照組比較，CVB3+Scrambled-siRNA組明顯升高(P<0.01)，敲減NLRP3表達后，同CVB3+NLRP3-siRNA組比較，CK-MB、cTnI的表達均有不同程度降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 ELISA檢測各組中CK-MB、cTnI的水平

2.3 敲減NLRP3基因的表達對病毒感染心肌細胞中NLRP3下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18的影響 在心肌細胞感染CVB3病毒的6～24 h，caspase-1的蛋白表達量明顯增加，見圖3A。敲減乳鼠心肌細胞中NLRP3基因的表達后，cleaved caspase-1的蛋白水平明顯降低，與CVB3+Scrambled-siRNA組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B。與CVB3+Scrambled-siRNA組相比，敲減NLRP3基因的表達后IL-1β、IL-18的含量明顯下降(P<0.05)，見圖3C、D。

同時采用Western blot檢測敲減NLRP3基因的表達后CVB3感染24 h IL-1β蛋白的變化，與CVB3+Scrambled-siRNA組相比較，敲減NLRP3基因的表達后IL-1β的蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3E。與ELISA檢測結(jié)果一致。進一步證明了抑制NLRP3的激活，可以抑制CVB3感染心肌細胞導(dǎo)致的IL-1β、IL-18的增加。

圖3 NLRP3基因沉默后其下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平的變化

2.4 敲減NLRP3基因的表達對病毒感染心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 正常對照組比較，CVB3+Scrambled-siRNA組的caspase-8表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但敲減NLRP3基因的表達后，與CVB3組比較caspase-8表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)。與正常對照組相比，CVB3+Scrambled-siRNA組cleaved caspase-3的蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；敲減NLRP3基因的表達后，cleaved caspase-3的蛋白水平與CVB3+Scrambled-siRNA組比較明顯降低(P<0.05)；Western blot法檢測cleaved caspase-9的結(jié)果表明，CVB3+Scrambled-siRNA組的cleaved caspase -9明顯高于正常對照組(P<0.05)；敲減NLRP3基因的表達后，與CVB3+Scrambled-siRNA組相比較，cleavedcaspase-9的蛋白水平有所下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組心肌細胞中凋亡蛋白caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平的變化

2.5 敲減NLRP3基因的表達對CVB3病毒感染心肌細胞中Bcl-2、Bax的影響 Western blot檢測與線粒體凋亡途徑相關(guān)的Bcl-2與Bax蛋白表達情況：與正常對照組相比，CVB3+Scrambled-siRNA組的Bcl-2蛋白表達量降低及Bax蛋白的表達明顯增加，Bax/Bcl-2比值增高(P<0.05)。敲減NLRP3基因的表達后，與CVB3+Scrambled-siRNA組對比， Bcl-2蛋白降低幅度減弱(P<0.05)；但對Bax蛋白表達無明顯影響(P>0.05)，Bax/Bcl-2比值一定程度降低(P<0.05)，見圖5。

圖5 各組心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達水平的變化

3 討論

病毒性心肌炎中最常見的病毒感染為CVB3病毒，其對心肌細胞的直接損傷主要包括炎癥反應(yīng)及心肌細胞凋亡[3-4]。病毒感染心肌細胞后激活心肌細胞內(nèi)相關(guān)炎癥信號通路，產(chǎn)生IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6等炎癥趨化因子募集炎癥細胞聚集產(chǎn)生炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細胞損傷。

NLRP3是NLRP亞家族中的一員，NLRP亞家族包含有NLRP1、NLRP2、NLRP3等，廣泛存在于細胞漿中[5]。NLRP3炎性體除了存在于巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞外，還存在于心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞以及心肌成纖維細胞的胞質(zhì)中[6]。本課題組前期研究顯示，血管緊張素Ⅱ刺激體外培養(yǎng)的H9C2細胞內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA及蛋白水平表達明顯升高，在細胞培養(yǎng)液上清液中IL-1β的含量也升高[7]。抑制心肌細胞中NLRP3的激活可以減輕糖尿病大鼠心肌炎癥反應(yīng)及心肌細胞損傷[8]。病毒性心肌炎導(dǎo)致心肌細胞中NLRP3激活的機制包括病毒RNA介導(dǎo)的激活、細胞內(nèi)ROS介導(dǎo)的激活和病毒孔蛋白介導(dǎo)的激活等3方面[9-11]。本課題組在病毒性心肌炎動物模型中研究顯示，在病毒感染小鼠第3天心肌組織中NLRP3炎性體被激活，其下游的caspase-1、IL-1β、IL-18表達增加，心肌組織中出現(xiàn)炎性細胞聚集[12]。既往研究還顯示，在病毒性心肌炎患者外周血中NLRP3被激活，并與疾病的嚴重程度成正相關(guān)，使用參麥及黃芪等藥物可以明顯抑制NLRP3升高，減輕炎癥反應(yīng)[13-15]。本研究顯示，病毒感染的心肌細胞內(nèi)NLRP3被激活，其下游因子caspase-1表達上調(diào)，IL-1β、IL-18生成增多，敲減NLRP3基因的表達后可一定程度抑制CVB3病毒感染引起的心肌細胞中 caspase-1的活化，一定程度抑制IL-1β、IL-18的表達。提示NLRP3參與了病毒感染心肌細胞早期的炎癥反應(yīng)過程，抑制NLRP3的過度激活，有可能減輕病毒性心肌炎的炎癥反應(yīng)損傷。

心肌細胞凋亡是病毒性心肌炎直接損傷心肌細胞的主要機制之一。在病毒性心肌炎中Fas/FasL外源性凋亡途徑[16-17]，Bcl-2/Bax線粒體凋亡途徑均被激活,最終導(dǎo)致caspase-3活化導(dǎo)致細胞凋亡[18-19]。既往研究報道，線粒體損傷可以激活NLRP3，同時NLRP3的激活進一步加重線粒體損傷[20]。在晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中，NLRP3、caspase-3和caspase-9的表增高，沉默NLRP3可通過抑制NF-κB P65來抑制caspase-3和caspase-9的增加，減輕心肌細胞凋亡[21]。有研究表明利用siRNA敲減NLRP3的表達可抑制心肌缺血再灌注心肌血管內(nèi)皮細胞凋亡，其機制可能與降低NF-κB的活化，上調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達有關(guān)[22]。還有研究顯示在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中用siRNA沉默NLRP3可抑制caspase-3的表達而減輕細胞凋亡[23]。shRNA干擾NLRP3后可以減輕心肌缺血再灌注大鼠模型中的心肌細胞損傷及凋亡，降低caspase-9、caspase-3凋亡蛋白的表達，其可能機制與抑制TGF-β/NF-κβp65/TNF-α炎癥通路活化有關(guān)[24]。敲減NLRP3基因的表達可以改善2型糖尿病大鼠模型中心功能，抑制心肌細胞凋亡[25]。細胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，多種細胞因子參與其中并受多種基因的調(diào)控。在這復(fù)雜的多因素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，除了上述的caspase家族以外，Bcl-2家族在細胞凋亡的過程中也起著重要的作用。因此，本研究為了探討在病毒感染心肌細胞中NLRP3對心肌細胞凋亡途徑的影響，使用siRNA沉默NLRP3基因，研究其對細胞內(nèi)外凋亡途徑的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CVB3感染的心肌細胞模型中，caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白水平均增加，Bcl-2表達降低，Bax表達增高，Bax/Bcl-2比值增加，細胞凋亡增加。這與既往的研究結(jié)果一致[26-27]。當(dāng)敲減NLRP3基因表達后，cleaved caspase-3、cleaved-caspase-9的蛋白水平降低，Bcl-2降低程度減弱，但是對caspase-8、Bax無明顯影響，Bax/Bcl-2比值降低，心肌細胞凋亡降低，提示在病毒性心肌炎中NLRP3可一定程度上促進線粒體凋亡途徑，加速細胞凋亡。本文主要在體外病毒感染心肌細胞模型中考察NLRP3的作用，同時只使用了基因干擾技術(shù)敲減NLRP3基因的表達來研究NLRP3的作用，未進行NLRP3基因過表達的研究，具有一定的局限性。

4 結(jié)論

在病毒感染心肌細胞中NLRP3被激活，其下游的因子表達增高，心肌細胞凋亡增加。抑制NLRP3過度激活，可一定程度上減輕心肌細胞炎癥損傷及線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細胞凋亡，提示NLRP3可能是病毒性心肌炎炎癥反應(yīng)與心肌細胞凋亡相互聯(lián)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。