陳思超 張冉 熊巧華 朱家永 張文杰 翁鴻,2,3,4 曾憲濤,2,3

(1. 武漢大學中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，湖北 武漢430071；2.武漢大學循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，湖北 武漢430071 ；3.武漢大學第二臨床學院循證醫(yī)學與臨床流行病學教研室，湖北 武漢 430071；4.武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科，湖北 武漢 430071)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中第二常見的惡性腫瘤，也是男性中第六常見的惡性腫瘤[1]。隨著人口老齡化、環(huán)境污染的加劇和診斷技術的提高，膀胱癌的發(fā)病率逐年上升[2-3]。膀胱癌主要由非侵襲性膀胱癌和侵襲性膀胱癌組成。其中，非侵襲性膀胱癌不侵犯膀胱肌層，約占70%[4]，標準治療方案為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術[5]，但術后1年內(nèi)疾病復發(fā)率為15%～60%[6-7]，總疾病復發(fā)率為40%～80%[8]。對于侵襲性膀胱癌患者，則推薦根治性膀胱切除術或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術聯(lián)合放療化療。膀胱癌的治療現(xiàn)狀目前仍不是非常令人滿意，更深入地明確疾病發(fā)生發(fā)展機制并尋找新的診治方法非常重要。PBK (PDZ-binding kinase,PBK) 也被稱為淋巴因子激活的殺傷T細胞源蛋白激酶(Lymphokine-Activated Killer T-Cell-Originated Protein Kinase，TOPK)，在有絲分裂調(diào)控過程中起重要作用。PBK在包括結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等多種腫瘤中高表達，且伴隨PBK高表達的腫瘤患者預后常常更差[9-10]。然而，關于PBK 與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展關系的研究卻較少。本研究將利用基因表達匯編(The Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫中的膀胱癌在線數(shù)據(jù)，分析并明確PBK基因的表達與膀胱癌生存預后的關聯(lián)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集來源 從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載膀胱癌基因表達數(shù)據(jù)GSE13507[11-12]。該數(shù)據(jù)集應用Illumina公司的Illumina human-6v2.0 expression bead chip基因表達芯片，其中PBK基因?qū)奶结槥镮LMN_1673673。GSE13507中包含165例原發(fā)性膀胱癌患者的基因表達數(shù)據(jù)及年齡、性別、侵襲性、臨床分級、TNM分期、疾病進展和疾病復發(fā)等臨床病理特征和生存狀態(tài)。

1.2 PBK表達與臨床病理特征和預后 應用兩獨立樣本t檢驗比較膀胱癌組織和正常膀胱組織的PBK基因表達量差異，然后根據(jù)PBK基因相對表達量的中位數(shù)將所有原發(fā)性膀胱癌樣本(n=165)分為低表達組(n=83)和高表達組(n=82), 接著應用2檢驗分析兩組患者臨床病理特征的差異，并應用Kaplan-Meier法和對數(shù)秩檢驗進行生存分析，從而探究PBK基因與原發(fā)性膀胱癌的臨床病理特征及預后的關聯(lián)。

1.3 基因富集分析 利用基因富集分析法(gene set enrichment analysis，GSEA)探索PBK表達對膀胱癌預后的影響的可能機制。從GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫中獲取hallmark gene sets基因集為參照基因集，按照默認加權(quán)富集統(tǒng)計的方法置換次數(shù)為1000次。以P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 24.0(IBM Corp.，Armonk，NY)和GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PBK在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的表達量比較 膀胱癌組織中PBK的相對表達量為 (8.30±0.99)，顯著高于正常膀胱組織 (7.49±0.69) (P<0.001)，見圖1。膀胱癌組織中PBK相對表達量中位數(shù)為8.19，故PBK相對表達量小于等于8.19的患者歸于低表達組，共83例。而PBK相對表達量大于8.19 的患者歸于高表達組，共82例。

圖1 PBK在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的表達量

2.2 PBK表達量與膀胱癌臨床病理特征 在GSE13507數(shù)據(jù)集中，PBK表達與性別(P<0.001)、年齡(P=0.027)、侵襲性(P<0.001)、分級(P<0.001)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.015)、M分期(P<0.001)、疾病進展(P<0.001)和疾病復發(fā)(P<0.001)顯著相關，見表1。

表1 PBK表達水平與臨床病理特征的關系

2.3 PBK高表達與膀胱癌預后 PBK高表達組的生存曲線比低表達組下降更為顯著，差異具有統(tǒng)計學差異(HR=0.5133，95%CI：0.3180～0.8283，P=0.0023)；PBK高表達的膀胱癌患者也具有更低的腫瘤特異性生存率(HR=0.2873，95%CI：0.1428～0.5781，P=0.0003)，見圖2。表明PBK高表達的膀胱癌患者總生存率更低。

圖2 PBK表達與膀胱癌預后

2.4 GSEA分析 PBK高表達的膀胱癌細胞樣本富集了與MYC信號通路、G2M檢查點、精子發(fā)生、E2F轉(zhuǎn)錄因子、未折疊蛋白反應相關的基因集，見表2。說明PBK可能通過影響上述信號通路、檢查點或生理過程來影響膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。

表2 基因集富集分析

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤。2018年全世界新發(fā)膀胱癌約有549000例，膀胱癌死亡病例約有200000例[1]。2014年中國新發(fā)膀胱癌約有78000例，全國膀胱癌死亡病例約為32100例[13]。當前膀胱癌仍是一種治療手段有限且治療效果欠佳的疾病，迫切需要新的診治方法問世。

PBK在腫瘤細胞的增殖過程中起重要調(diào)控作用[14]。PBK的敲除會導致G2/M細胞周期阻滯和細胞凋亡[15]。此外，PBK也與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。Yang等[16]研究表明PBK在肝癌細胞中高表達，通過ETV4-uPAR信號通路促進肝癌細胞侵襲和遷移，與肝癌患者預后差密切相關。Ma等[17]研究表明PBK促進高級別漿液性卵巢癌的轉(zhuǎn)移，且與鉑類化療藥物抵抗相關，其高表達會降低患者生存率。Ohashi等[18]研究表明，PBK的高表達與胃癌血管侵襲、腫瘤深度和復發(fā)率顯著相關，PBK高表達的胃癌患者具有更低的腫瘤特異性生存率。

Krempler等[19]研究表明，G2M檢查點的不完整與電離輻射后S期和G2期細胞的染色體不穩(wěn)定性相關。且另有研究表明，G2M檢查點表達的下調(diào)或消除與細胞凋亡有關[20-21]。本研究顯示，當PBK高表達時，膀胱癌中G2M檢查點的表達量是相對高的，表明高表達的PBK可能是通過上調(diào)G2M的表達使膀胱癌細胞凋亡受阻，從而影響膀胱癌患者預后。當PBK表達上調(diào)時，精子發(fā)生過程中的基因也呈現(xiàn)相對高表達。癌癥/睪丸抗原是一種僅在精子發(fā)生過程中的生殖細胞中和某些腫瘤細胞中特異性表達的抗原，起原癌基因或抑癌基因的作用[22]。PBK已被證實是一種在乳腺癌細胞中表達的新型癌癥/睪丸抗原[23]。李小輝等[24]研究表明當膀胱癌細胞的E2F通路蛋白表達被microRNA-503-5P抑制時，細胞生長被抑制。本研究中PBK高表達時E2F通路蛋白的表達量相對較高。此外，之前的研究也表明膀胱癌細胞外小泡可通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白反應使非惡性尿路上皮細胞完成惡性轉(zhuǎn)化[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)PBK基因在膀胱癌中高表達，且PBK表達量與膀胱癌侵襲性、臨床分級、TNM分期以及疾病復發(fā)、進展密切相關，PBK表達量高的患者疾病總生存率和腫瘤特異性生存率均顯著低于PBK量低的患者。此外，GSEA分析發(fā)現(xiàn)PBK可能通過作用于MYC信號通路、G2M檢查點、精子發(fā)生、E2F轉(zhuǎn)錄因子通路、未折疊蛋白反應等腫瘤相關的信號通路或檢查點或生物學過程影響膀胱癌的預后?；谝陨辖Y(jié)果，PBK可能成為膀胱癌新型腫瘤標志物或者治療靶點。我們的研究也有其局限性，首先這是一個回顧性研究，尚不能確定；其次，本文只是對PBK調(diào)控的信號通路或生理過程做出假設，還需進一步的臨床基礎研究最終確定PBK基因影響膀胱癌預后的具體通路。

4 結(jié)論

PBK在膀胱癌中高表達，與膀胱癌的多個臨床病理特征相關，這可能成為膀胱癌新型腫瘤標志物或者治療靶點。