張海洋，田 琳，祁智慧，唐 芳?

（國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

目前，真菌危害仍是影響儲(chǔ)糧安全的重要因素之一[1-3]。例如：真菌生命代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生熱量，引起儲(chǔ)糧害蟲生命活動(dòng)[4]；真菌的生長會(huì)導(dǎo)致糧食發(fā)芽率降低[5-6]；真菌在糧食中大量繁殖會(huì)產(chǎn)生霉味，使糧食變色，從而使儲(chǔ)糧品質(zhì)下降[7-8]；產(chǎn)毒真菌在糧食中繁殖產(chǎn)生的真菌毒素更是嚴(yán)重影響糧食的食品衛(wèi)生安全[9-10]。

儲(chǔ)糧中常見的真菌主要是曲霉屬和青霉屬真菌[11-12]，通過肉眼很難對其侵染情況進(jìn)行定量測算。傳統(tǒng)的儲(chǔ)糧微生物檢測方法是平板菌落計(jì)數(shù)法[13]，將單個(gè)細(xì)胞或孢子培養(yǎng)成肉眼可見的菌落，通過統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)計(jì)算樣品帶菌量，進(jìn)而評(píng)價(jià)微生物污染程度，但該方法檢測時(shí)間長，菌落培養(yǎng)需5～7 d，且對檢驗(yàn)人員的專業(yè)技能及實(shí)驗(yàn)條件要求較高，糧食行業(yè)實(shí)際操作難度較大[14-16]。目前我國糧食行業(yè)通過對糧堆溫度檢測來實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)糧霉變發(fā)熱的防控[17-19]，溫度檢測存在嚴(yán)重滯后，當(dāng)溫度異常升高時(shí)，糧堆微生物已經(jīng)開始大量繁殖，嚴(yán)重影響糧食品質(zhì)。本項(xiàng)目研發(fā)團(tuán)隊(duì)經(jīng)過多年研究，基于傳統(tǒng)的微生物菌落計(jì)數(shù)法，建立了一個(gè)儲(chǔ)糧微生物早期快速檢測方法—孢子計(jì)數(shù)法[20]，并于 2018年 3月上升為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布實(shí)施[21]。孢子計(jì)數(shù)法省略菌落培養(yǎng)過程，以顯微放大技術(shù)直接對樣品上洗脫的孢子進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，簡化實(shí)驗(yàn)條件，縮短檢測時(shí)間。但顯微鏡操作及真菌孢子識(shí)別需一定微生物學(xué)基礎(chǔ)，對于基層糧庫保管人員仍具有一定難度，基于上述原因，團(tuán)隊(duì)研發(fā)了儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測儀。該儀器采用自動(dòng)位移對焦算法[22-23]以及圖像識(shí)別技術(shù)，對孢子計(jì)數(shù)法中涉及的顯微鏡操作和真菌孢子識(shí)別實(shí)現(xiàn)儀器自動(dòng)化，降低人員操作難度和誤差，便于檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的推廣應(yīng)用，盡早服務(wù)于儲(chǔ)糧行業(yè)霉變發(fā)熱的早期預(yù)警。

1 儲(chǔ)糧真菌檢測方法的原理及操作

糧食儲(chǔ)藏過程中，主要儲(chǔ)糧真菌的生長伴隨著真菌孢子的產(chǎn)生，孢子數(shù)量與儲(chǔ)糧真菌滋生顯著相關(guān)，通過檢測真菌孢子數(shù)量的變化，可對儲(chǔ)糧真菌生長情況進(jìn)行判定。孢子計(jì)數(shù)法的檢測結(jié)果與平板菌落計(jì)數(shù)法具有很好的相關(guān)性[20]。具體操作方法為，稱取一定數(shù)量的糧食樣品，加水劇烈振蕩，洗脫糧食表面生長的真菌孢子，洗脫液經(jīng)過濾后加入計(jì)數(shù)板中，置于顯微鏡下，對洗脫的孢子進(jìn)行識(shí)別計(jì)數(shù)。操作細(xì)節(jié)要求可參見行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[21]，操作流程如圖1。

圖1 真菌孢子計(jì)數(shù)法操作流程Fig.1 Operation process of fungal spore counting method

由操作流程圖可看出，樣品的前處理振蕩洗脫操作簡單，但顯微成像技術(shù)需要一定的微生物學(xué)基礎(chǔ)?；鶎訖z測人員在使用該方法時(shí)，由于大部分檢測人員不具備微生物學(xué)基礎(chǔ)，對于顯微鏡的成像調(diào)試操作以及儲(chǔ)糧真菌孢子的識(shí)別存在很大問題，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，本研究考慮將顯微鏡成像操作及真菌孢子識(shí)別實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和智能化，以降低基層糧庫檢驗(yàn)人員的操作難度，減少真菌孢子識(shí)別錯(cuò)誤導(dǎo)致的檢測誤差。

2 儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測儀設(shè)計(jì)方案

儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測儀主要實(shí)現(xiàn)糧食上洗脫的真菌孢子在顯微鏡下能夠自動(dòng)對焦拍照、自動(dòng)識(shí)別計(jì)數(shù)及結(jié)果輸出。自動(dòng)檢測儀由顯微成像硬件、圖像識(shí)別軟件和中控軟件三部分組成。儀器總體設(shè)計(jì)框架如圖2。

圖2 儀器整體設(shè)計(jì)框架Fig.2 The overall design framework of the instrument

檢測人員按照行標(biāo)LS/T 6132《糧油檢驗(yàn)糧食真菌檢測方法孢子計(jì)數(shù)法》要求對糧食樣品進(jìn)行前處理，將洗脫液滴入計(jì)數(shù)板后送入真菌自動(dòng)檢測儀靜置待檢。顯微鏡成像硬件，首先將計(jì)數(shù)板自動(dòng)送入待檢區(qū)，用圖像清晰度算法對孢子計(jì)數(shù)區(qū)進(jìn)行自動(dòng)對焦和顯微成像，當(dāng)顯微視野下呈現(xiàn)真菌孢子清晰界面時(shí)進(jìn)行自動(dòng)拍照，并將照片發(fā)送給中控軟件。圖像識(shí)別軟件，接收中控軟件發(fā)送來的圖片，調(diào)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖像識(shí)別算法對照片中真菌孢子進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別、標(biāo)記并計(jì)數(shù)，標(biāo)記后的圖片和計(jì)數(shù)結(jié)果一起發(fā)送給中控軟件。中控軟件作為人機(jī)交互軟件，可對接和控制顯微成像硬件及圖像識(shí)別軟件，將識(shí)別及判定結(jié)果向操作人員進(jìn)行可視化輸出。

3 顯微自動(dòng)成像硬件

3.1 硬件結(jié)構(gòu)組成

顯微自動(dòng)成像硬件主要由控制主板、顯微自動(dòng)對焦系統(tǒng)及自動(dòng)位移臺(tái)組成，如圖3所示。

圖3 顯微自動(dòng)成像硬件結(jié)構(gòu)Fig.3 Hardware structure of automatic microscopic imaging

控制主板實(shí)現(xiàn)對自動(dòng)位移及自動(dòng)對焦成像系統(tǒng)的控制，由主控芯片和步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)芯片組成。自動(dòng)位移臺(tái)是通過步進(jìn)電機(jī)控制樣品臺(tái)在XY軸移動(dòng)，將計(jì)數(shù)板送入自動(dòng)識(shí)別區(qū)，減少了檢測人員尋找計(jì)數(shù)區(qū)的操作。自動(dòng)對焦系統(tǒng)是Z軸方向通過對不同焦距的圖像進(jìn)行清晰度評(píng)價(jià)，找到目標(biāo)真菌孢子最佳焦距，從而拍攝出可供識(shí)別的清晰孢子圖像，解決人為視覺誤差導(dǎo)致對焦效果不一致的問題。

3.2 自動(dòng)對焦成像算法及效果評(píng)價(jià)

自動(dòng)對焦成像效果是實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測的關(guān)鍵第一步。真菌孢子體積非常小，有些真菌孢子直徑只有2～3 μm[24]，要求自動(dòng)對焦算法的誤差也必須控制在2～3 μm，如果對焦誤差超出有效焦距范圍，即會(huì)出現(xiàn)成像模糊現(xiàn)象，無法達(dá)到自動(dòng)成像拍照的目的。

自動(dòng)對焦成像主要通過對焦算法實(shí)現(xiàn)。我們選擇了顯微成像四種常用對焦算法進(jìn)行測試和評(píng)價(jià)，四種算法包括：Brenner梯度函數(shù)、Tenengard梯度函數(shù)、Laplacian梯度函數(shù)、Variance方差。采用物鏡從不同高度返回對焦點(diǎn)的偏差，對四種對焦算法自動(dòng)對焦效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，即將清晰對焦面設(shè)置為檢測原點(diǎn)，手動(dòng)調(diào)節(jié)物鏡至不同高度來測試算法返回原點(diǎn)的能力，測試結(jié)果如表 1，對焦離散偏差如圖4。

表1 不同算法對焦偏差比較Table 1 Comparison of focus deviation of different algorithms μm

圖4 不同算法對焦離散偏差Fig.4 Focus discretization deviation of different algorithms

由表1和圖4可知，Brenner算法的對焦高度平均偏差和對焦離散偏差最小，明顯優(yōu)于其它三個(gè)算法。Bernner函數(shù)原理為計(jì)算相鄰兩個(gè)像素灰度差的平方，計(jì)算簡單，計(jì)算量小，更適用于真菌孢子小目標(biāo)的對焦計(jì)算。

4 真菌孢子圖像識(shí)別軟件

4.1 構(gòu)建真菌孢子圖庫

構(gòu)建具有足夠代表性的儲(chǔ)糧真菌孢子圖庫是真菌孢子圖像識(shí)別的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)室選擇儲(chǔ)糧常見危害真菌，挑取純種培養(yǎng)菌株與實(shí)際糧食樣品洗脫物混合，顯微鏡下拍照，人工識(shí)別區(qū)分真菌孢子與糧食雜質(zhì)并做標(biāo)記，為識(shí)別模型的構(gòu)建提供大量的訓(xùn)練集圖片。實(shí)驗(yàn)室已訓(xùn)練的菌種包含阿姆斯特丹曲霉、擬灰綠曲霉、皮落靑霉、黃曲霉、黑曲霉等十余個(gè)純種菌株。后期增加了實(shí)際糧食樣品洗脫真菌孢子圖片，已拍攝照片2 000余張，訓(xùn)練儲(chǔ)糧真菌孢子樣本1萬余個(gè)。

4.2 真菌孢子圖像識(shí)別算法

真菌孢子識(shí)別效果是實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測的核心，需要借助于圖像識(shí)別技術(shù)實(shí)現(xiàn)，本儀器采用了卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖像識(shí)別算法，是與北京郵電大學(xué)合作共同研究完成，該算法具有預(yù)處理簡單，識(shí)別準(zhǔn)確率高的優(yōu)點(diǎn)[22]。

該算法主要由 RPN區(qū)域候選網(wǎng)絡(luò)和 Faster R-CNN目標(biāo)檢測組成，F(xiàn)aster R-CNN提起候選圖像特征圖，RPN區(qū)域候選網(wǎng)絡(luò)生成區(qū)域候選框，F(xiàn)aster R-CNN基于RPN提取的候選框檢測并識(shí)別候選區(qū)域中的目標(biāo)。其識(shí)別流程為：真菌孢子圖像輸入卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，提取圖像特征，生成區(qū)域候選框、對孢子特征圖及區(qū)域候選框進(jìn)行分類回歸，輸出得到真菌孢子標(biāo)記圖像。識(shí)別流程和標(biāo)記圖像輸出如圖5和圖6。

圖5 卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別示意圖Fig.5 Schematic diagram of convolution neural network image recognition

圖6 真菌孢子識(shí)別標(biāo)記圖像Fig.6 Marking image of fungal spore identification

4.3 真菌孢子圖像識(shí)別效果評(píng)價(jià)

對已訓(xùn)練過擬灰綠曲霉、皮落青霉、白曲霉進(jìn)行識(shí)別準(zhǔn)確率測試，測試單一菌種的識(shí)別準(zhǔn)確率，并對吉林染菌糧食樣品孢子洗脫液進(jìn)行識(shí)別，測試結(jié)果如表2。

表2 真菌孢子圖像識(shí)別測試Table 2 Recognition test of fungal spore image

識(shí)別軟件對于已訓(xùn)練過的菌種孢子的識(shí)別準(zhǔn)確率能達(dá)到90%以上，但是對于實(shí)際染菌糧食樣品洗脫的真菌孢子識(shí)別準(zhǔn)確率為 78.0%，造成識(shí)別準(zhǔn)確率降低的原因主要有兩點(diǎn)，一是染菌糧食樣品上的真菌孢子與實(shí)驗(yàn)室純種培養(yǎng)的真菌孢子在直徑和形態(tài)上存在一定差異；二是真菌孢子形態(tài)上非常接近，在菌種分類上存在一定誤差。針對上述問題，我們增加了實(shí)際染菌糧食上洗脫孢子的圖片進(jìn)行訓(xùn)練，另一方面，真菌污染等級(jí)是按照真菌總數(shù)進(jìn)行劃分，真菌種類有參考價(jià)值，但不是等級(jí)劃分的必要條件，因此識(shí)別結(jié)果只做孢子標(biāo)記，不做種類標(biāo)記，以總菌數(shù)計(jì)算。

增加吉林糧食樣品洗脫孢子進(jìn)行訓(xùn)練，訓(xùn)練樣本5 000余個(gè)，訓(xùn)練結(jié)束后，分別對吉林、寧夏、長沙樣品進(jìn)行圖像識(shí)別，結(jié)果見表3。

表3 補(bǔ)充樣本后孢子識(shí)別準(zhǔn)確率Table 3 Spore identification accuracy rate after replenishing the sample

增加實(shí)際儲(chǔ)糧樣本后，識(shí)別準(zhǔn)確率有了顯著提升，對于其它地區(qū)儲(chǔ)糧真菌孢子識(shí)別準(zhǔn)確率可達(dá)到80%以上。由此可見，可通過后續(xù)擴(kuò)充實(shí)際儲(chǔ)糧的樣品進(jìn)行訓(xùn)練，不斷提高識(shí)別準(zhǔn)確率。

5 中控軟件設(shè)計(jì)

中控軟件作為人機(jī)交互軟件，對接顯微成像硬件及圖像識(shí)別軟件，并將孢子識(shí)別及判定結(jié)果向操作人員進(jìn)行可視化輸出。人機(jī)交互界面分為控制區(qū)、視野區(qū)和統(tǒng)計(jì)區(qū)?？刂茀^(qū)為備檢樣品選擇操作區(qū)。選擇檢測區(qū)后，啟動(dòng)檢測程序，顯微成像控制硬件將相應(yīng)檢測區(qū)移動(dòng)至物鏡下，進(jìn)行自動(dòng)對焦、拍攝及識(shí)別。視野區(qū)為孢子圖像展示區(qū)。圖像識(shí)別軟件對真菌孢子圖像識(shí)別完畢后，識(shí)別縮略圖平鋪于視野區(qū)，打開其任意一張縮略圖后，可看到該張圖片的具體識(shí)別標(biāo)記結(jié)果。統(tǒng)計(jì)區(qū)為最終結(jié)果顯示區(qū)。識(shí)別軟件對檢測區(qū)圖像識(shí)別完畢后，中控軟件根據(jù)真菌孢子識(shí)別計(jì)數(shù)結(jié)果，進(jìn)行儲(chǔ)糧真菌生長程度判定，并將孢子計(jì)數(shù)結(jié)果及真菌生長等級(jí)呈現(xiàn)給用戶。中控軟件界面設(shè)計(jì)如圖7。

圖7 中控軟件界面Fig.7 Interface of central control software

6 結(jié)論

本研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖像識(shí)別技術(shù)和自動(dòng)位移對焦算法，將LS/T 6132《糧油檢驗(yàn)糧食真菌檢測方法孢子計(jì)數(shù)法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中涉及專業(yè)技能操作的環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)智能化和自動(dòng)化，研發(fā)了儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測儀。該儀器通過設(shè)計(jì)自動(dòng)位移對焦系統(tǒng)，自動(dòng)對焦偏差小于真菌孢子圖像清晰呈現(xiàn)有效焦距范圍，可實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)糧真菌孢子的自動(dòng)對焦成像并拍照；首次采用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)糧真菌孢子圖像的自動(dòng)識(shí)別，對純種培養(yǎng)的真菌孢子識(shí)別準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上，對于實(shí)際糧食樣品上洗脫的真菌孢子識(shí)別準(zhǔn)確率可達(dá)到80%以上，通過擴(kuò)大實(shí)際污染糧食上孢子樣本的訓(xùn)練集，可進(jìn)一步提高識(shí)別的準(zhǔn)確率。儲(chǔ)糧真菌自動(dòng)檢測儀操作簡便、快速、準(zhǔn)確率高，可大幅降低檢測人員操作難度和誤差，在基層糧庫和質(zhì)檢部門適用性強(qiáng)，便于儲(chǔ)糧真菌檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的推廣應(yīng)用。

本項(xiàng)目研發(fā)團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)增加孢子圖庫中的訓(xùn)練集圖片，將鐮刀菌屬物種、鏈格孢屬物種及其它常見的產(chǎn)毒真菌引入，作為訓(xùn)練的菌種。擴(kuò)大識(shí)別軟件的識(shí)別范圍，提高識(shí)別的準(zhǔn)確率。早日實(shí)現(xiàn)糧食中危害真菌的早期快速檢測，為及時(shí)、有效防控真菌污染提供技術(shù)支持，最終實(shí)現(xiàn)服務(wù)于糧食行業(yè)，保障國家糧食安全的目標(biāo)。

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