郭 琰，馬雅鴿，張 希，陳朝銀，趙聲蘭?

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650500）

高脂血癥（HLP）是指血漿中的脂蛋白譜異常，一般特指總膽固醇(TC)、甘油三酯（TG）升高，伴或不伴高密度脂蛋白（HDL-C）降低和（或）低密度脂蛋白（LDL-C）升高[1]，是腦卒中、心臟猝死、高血壓、糖尿病、脂肪肝及肥胖的重要因素。研究表明核桃粕提取物對(duì)谷氨酸鈉誘導(dǎo)的肥胖小鼠和 3T3-L1脂肪細(xì)胞具有較強(qiáng)的降脂作用[2]，能顯著調(diào)節(jié)肝臟和血清中脂質(zhì)水平以及下調(diào)參與膽固醇吸收的蛋白質(zhì)（ABCG5/8和NPC1L1）表達(dá)[3]。

核桃又名胡桃、弟桃，系胡桃科胡桃屬植物，位居“四大干果”之首，是一種藥食兼?zhèn)涞膬?yōu)良經(jīng)濟(jì)作物[4]。不僅味道鮮美，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，古書記載其有補(bǔ)腎、溫肺、潤(rùn)腸之功，又有強(qiáng)身健腦、駐顏延年之用故又有“萬(wàn)歲子、長(zhǎng)壽果”、“益智果”、“美容果”的美譽(yù)[5]。核桃經(jīng)榨油后得到的副產(chǎn)物——核桃粕，呈片狀或粉末狀[6]。由于核桃粕成分復(fù)雜多樣，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析核桃粕降脂的作用成分及其靶點(diǎn)和機(jī)理，為核桃粕用于高脂血癥提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 核桃粕活性成分及潛在靶點(diǎn)的篩選

通過(guò) TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology）（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)[7]和相關(guān)文獻(xiàn)獲得核桃粕的化學(xué)成分及相應(yīng)潛在靶點(diǎn)?？诜锢枚龋∣B）反映藥物口服進(jìn)入體循環(huán)的比例[8]，類藥性（DL）是根據(jù)混合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)表征成藥特性，用于藥物發(fā)現(xiàn)早期的初篩[9]。通常以O(shè)B≥15%和DL≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 HLP靶點(diǎn)搜集

使用 GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)[10]，以“ hyperlipidemia”、“ hypercholesterolemia”、“hypertriglyceridemia”為關(guān)鍵詞搜索 HLP相關(guān)靶點(diǎn)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)進(jìn)行歸并得到HLP的靶點(diǎn)，以評(píng)分≥3為篩選條件，搜集HLP相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 藥物–活性成分–疾病–靶點(diǎn)

將核桃粕的潛在靶點(diǎn)與HLP相關(guān)的靶蛋白使用Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，即為核桃粕作用于HLP的潛在靶標(biāo)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)信息整理成 Excel格式導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.7.2（http://cytoscape.org/，v3.7.2）構(gòu)建核桃粕“活性成分–藥物–疾病–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并運(yùn)用Meta-analysis和Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)：選取節(jié)點(diǎn)度(Degree)前三位的活性成分為主要活性成分[11]，進(jìn)一步了解核桃粕活性成分與HLP相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。目前STRING (search tool for recurring instances of neighbouring genes)是蛋白質(zhì)相互作用覆蓋種類最多的數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）在線分析平臺(tái)以獲得蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI）。蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用評(píng)分的置信度設(shè)置為0.900，并隱藏?zé)o相互作用的蛋白。將獲得的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)出為 TSV文件格式并導(dǎo)入到 Cystoscape 3.7.2軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，Degree值越大代表了該點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中越重要，進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選。

1.5 GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析

使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析。主要進(jìn)行細(xì)胞、分子和生物三方面功能富集分析，以統(tǒng)計(jì)學(xué)超幾何分布定量（P值）評(píng)估相關(guān)性，設(shè)置P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃粕活性成分篩選結(jié)果

綜合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和文獻(xiàn)報(bào)道，以O(shè)B≥15%，DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核桃粕活性成分 14種（見表 1）[13-21]。其中有 12個(gè)成分口服生物利用度 OB≥30%，如芥子酸（Sinapic acid,64.15）、咖啡酸（Caffeic acid,54.97）、兒茶素（Catechin,54.83）、褪黑素（Melatonin,52.96）、丁香酸（Syringic acid,47.78）、槲皮素（Quercetin,46.43）、香豆酸（Coumaric acid,43.29）、鞣花酸（Ellagic acid,43.06）、Glansreginin B（41.37）、阿魏酸（Ferulic acid,39.56）、Glansreginin A（35.16）、沒食子酸（Gallic acid,31.69），但綠原酸（Chlorogenic acid,13.61）和蘆?。≧utin,3.2）較低。而類藥性DL滿足篩選要求的則依次為蘆?。?.68）、Glansreginin A（0.64）、Glansreginin B（0.63）、鞣花酸（0.43）、綠原酸（0.31）、兒茶素（0.24）、槲皮素（0.28）共7個(gè)。但從臨床來(lái)看無(wú)論是口服生物利用度較低的綠原酸（Chlorogenic acid,13.61）、蘆丁（Rutin,3.2）或類藥性較低的褪黑素等有口服制劑的報(bào)道。

表1 核桃粕潛在活性成分Table 1 Potential active ingredients of walnut cold-press meal

2.2 核桃粕作用于HLP的潛在靶點(diǎn)

基于所獲得的14種化合物進(jìn)行搜索，僅芥子酸；咖啡酸；兒茶素；褪黑素；丁香酸；槲皮素；香豆酸；鞣花酸；阿魏酸；沒食子酸；綠原酸；蘆丁共 12種化合物具有 256個(gè)潛在靶點(diǎn)。從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得1 236個(gè)HLP的潛在靶點(diǎn)（評(píng)分≥25）。通過(guò)Draw Venn Diagram將HLP相關(guān)基因和核桃粕的潛在靶點(diǎn)相交，結(jié)果顯示只有7個(gè)成分的59個(gè)潛在靶標(biāo)與HLP相關(guān)（見表2和圖1）。

表2 核桃粕成分中與HLP相關(guān)的潛在靶點(diǎn)Table 2 Potential targets related to HLP in walnut cold-press meal

續(xù)表

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建核桃粕“活性成分–藥物–疾病–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖 1）。網(wǎng)絡(luò)圖包含68個(gè)節(jié)點(diǎn)，核桃粕活性成分7個(gè)，作用靶點(diǎn)59個(gè)，144條相互作用的邊。作用靶點(diǎn)最多的成分為槲皮素、蘆丁、兒茶素、芥子酸和鞣花酸；受最多化合物作用的靶點(diǎn)為透明質(zhì)酸合酶 2（HAS2）、核受體輔活化因子2（NCOA2）、雌激素受體（ESR1）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、雄激素受體（AR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A（VEGFA）和NHLPPH——細(xì)胞色素P450還原酶（POR）。

圖1 核桃粕活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active ingredient of walnut cold-press meal-target network diagram

將 59個(gè)靶基因輸入 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，獲得靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見圖 2左）。關(guān)鍵蛋白為白介素-6（IL6）、胰島素（INS）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、腫瘤蛋白P53（TP53）等（見圖2右）。這些蛋白可能在核桃粕降脂中起關(guān)鍵作用。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（左）和關(guān)鍵蛋白排序（右）Fig.2 Protein-protein interaction (PPI) network diagram (left) and key protein sequencing (right)

2.4 GO功能富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)核桃粕的59個(gè)HLP相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞、分子和生物三方面功能富集分析(P<0.01)（見圖 3）。其中生物過(guò)程主要包括對(duì)一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic,P=1.18E-10）、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide,P=1.66E-10）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response,P=4.05E-10）、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)（cellular response to hypoxia,P=3.79E-08）和血管舒張的積極調(diào)節(jié)（positive regulation of vasodilation,P=4.59E-08）等；細(xì)胞成分主要涉及細(xì)胞外空間（extracellular space,P=3.02E-19）、細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region,P=5.19E-08）、小窩（caveola,P=1.95E-06）、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm,P=1.40E-04）和細(xì)胞表面（cell surface,P=3.01E-04）等；分子功能主要涉及酶結(jié)合（enzyme binding,P=1.13E-09）、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活序列特異性 DNA 結(jié)合（RNA polymerase II transcription factor activity,ligand-activated sequence-specific DNA binding,P=1.40E-07）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding,P=2.13E-07）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity,P=1.34E-06）和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding,P=5.38E-06）等。表明相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)調(diào)控不同生物學(xué)功能作用于HLP。

圖3 GO功能富集圖（左：前10個(gè)生物進(jìn)程；中：前10個(gè)細(xì)胞成分；右：前10個(gè)分子功能）Fig.3 GO functional enrichment diagram (left:top 10 biological processes; middle:top 10 cell components;right:top 10 molecular functions)

2.5 KEGG通路分析

對(duì)核桃粕的59個(gè)HLP相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析得到86條通路，篩選（P<0.01）得到46條相關(guān)通路，前20條重要通路（見圖4）。其中，HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway,P=1.39E-09），TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway,P=4.07E-09），南美錐蟲?。乐掊F蟲?。–hagas disease (American trypanosomiasis),P=5.22E-08），瘧疾（Malaria,P=5.45E-08）可能為核桃粕不同成分作用于HLP的關(guān)鍵通路。

圖4 KEGG通路分析圖Fig.4 KEGG pathway analysis diagram

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為高脂血癥的發(fā)生與臟腑功能失調(diào)有密切的聯(lián)系，外多為嗜食肥甘厚味，內(nèi)與脾腎運(yùn)化失職，肝膽疏泄失調(diào)相關(guān)，二者終致氣機(jī)阻滯，痰瘀內(nèi)聚，膏脂不歸正化[22]。核桃粕為核桃取油后的副產(chǎn)物，課題組的前期研究表明核桃粕乙醇提取物具有顯著降脂作用[13]，可改善II型糖尿病模型大鼠肝臟脂肪變性，改善肝臟脂質(zhì)積累并提高肝臟抗氧化能力，可極顯著地降低大鼠血清和肝臟中TG、TC蓄積，改善肝臟和胰腺的病理?yè)p傷，對(duì)高脂高糖高膽固醇誘導(dǎo)的II型糖尿病大鼠有良好的預(yù)防作用[13]。除此之后其他文獻(xiàn)中也闡明了核桃粕有降脂作用[23]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)闡述藥物成分與機(jī)體相互作用的原理與規(guī)律，可用來(lái)預(yù)測(cè)中藥單體[24]或復(fù)方[25]的各有效成分及其作用靶點(diǎn)和參與的相關(guān)通路，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，解釋中藥治療疾病的作用機(jī)理。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選得到核桃粕12種活性成分具有HLP相關(guān)的潛在靶點(diǎn)59個(gè)，主要為酚類、黃酮類化合物。槲皮素、蘆丁、兒茶素、芥子酸和鞣花酸等顯示出較強(qiáng)的靶向作用，均可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降血脂。黃酮類化合物和多酚類化合物被認(rèn)為是脂肪組織和肝臟中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子。黃酮類化合物能抑制磷酸二酯酶[26]，化合物中的多酚降脂歸因于它們的抗氧化作用，從而抑制LDL氧化，改變肝臟膽固醇吸收、三?；视徒M裝和分泌[27]。肥胖是一種慢性低度炎癥狀態(tài)，在肥胖狀態(tài)下，肥大、增生的脂肪細(xì)胞會(huì)分泌大量的促炎癥因子如白細(xì)胞介素6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Mcp-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，進(jìn)而誘發(fā)各種疾病，槲皮素能夠有效改善高脂引起的炎癥因子的表達(dá)異常，所涉及的靶點(diǎn)均為本研究中發(fā)現(xiàn)的HLP相關(guān)重要靶點(diǎn)[28-29]。IL-6、TNF在炎癥和B細(xì)胞成熟中起作用，并具有多種生物學(xué)功能，如參與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分化，對(duì)肝細(xì)胞發(fā)揮作用，且上述蛋白已成為高血壓高脂血癥發(fā)展的重要指標(biāo)[30-31]。鞣花酸物具有清除自由基的能力，對(duì)低密度脂蛋白膽固醇體外氧化改性的敏感性具有保護(hù)作用[2]。本研究獲得的透明質(zhì)酸合酶 2（HAS2）、核受體輔活化因子2（NCOA2）、雌激素受體（ESR1）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、雄激素受體（AR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A（VEGFA）和 NHLPPH-細(xì)胞色素P450還原酶（POR），可能是HLP的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞并并調(diào)節(jié)血管通透性的作用[32]。高脂血癥在誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中，炎癥細(xì)胞因子，如VEGF和TNF-α?xí)T發(fā)血管血栓的形成，同時(shí)導(dǎo)致大量正常的細(xì)胞凋亡，加劇病情的發(fā)展[33]。核桃粕可以通過(guò)提高機(jī)體主要的過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度，從而促進(jìn)降脂效果。

KEGG通路分析獲得的一條重要通路為HIF-1信號(hào)通路，高脂血癥的發(fā)生，發(fā)展以及并發(fā)癥常伴有炎癥[34]和內(nèi)皮功能障礙[35]，炎癥組織的特征在于低氧狀況和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，TNF信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路主要涉及炎癥反應(yīng)和缺氧[36]。Mylonis等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，HIF對(duì)維持細(xì)胞代謝平衡起重要作用，因?yàn)镠IF可以上調(diào)糖酵解通路以及降低線粒體功能，同時(shí)缺氧也可以增強(qiáng)脂肪生成，主要是因?yàn)樯婕爸舅幔‵A）攝取，合成和儲(chǔ)存的基因由HIF依賴性誘導(dǎo)，所以 HIF參與糖代謝與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。HIF-1信號(hào)通路中的低氧誘導(dǎo)因子 1（HIF-1），是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞在低氧環(huán)境下的反應(yīng)，在過(guò)氧化物酶體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[38]，HIF-1通過(guò)激活肝組織中脂素lipin 1的表達(dá)，從而導(dǎo)致活性氧的減少和防止肝脂質(zhì)沉積[39]。胰島素信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪分解，與胰島素抵抗密切相關(guān)[40]。核桃粕在脂肪細(xì)胞的分化和減少三?；视偷姆e累中起重要作用。因此，核桃粕能夠減少或抑制脂肪的形成，使其成為預(yù)防和治療肥胖的潛在治療劑[29]。

綜上所述，核桃粕中的多個(gè)有效成分能同時(shí)作用于2個(gè)以上的靶點(diǎn)，并對(duì)應(yīng)多條信號(hào)通路，在抗炎、抗氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用，表明核桃粕通過(guò)多途徑多靶點(diǎn)干預(yù)高脂血癥的分子機(jī)制，主要作用為改善肝臟脂質(zhì)積累、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)糖代謝等多個(gè)方面，同時(shí)對(duì)糖尿病、胰島素抵抗等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病起著多重協(xié)同效應(yīng)。盡管目前HLP的發(fā)病機(jī)理尚不明確，核桃粕的降脂功能也有待開發(fā)，但借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示核桃粕可從多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同干預(yù)HLP的發(fā)生和發(fā)展，為核桃粕防治HLP的功能成分和靶點(diǎn)機(jī)理提供數(shù)據(jù)和理論支持。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn）、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。