劉仕成，李鑫輝，陳欣

丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬及血管生成的影響

劉仕成，李鑫輝，陳欣

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

觀察丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）自噬及血管生成的影響，探討其作用機(jī)制。建立CMECs缺氧/復(fù)氧損傷模型，將CMECs隨機(jī)分為空白組、模型組、丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組、3-MA自噬抑制劑組，除空白組外其余各組均置于低糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)置于37 ℃、94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，換正常DMEM培養(yǎng)基，給氧3 h，再給予相應(yīng)藥物干預(yù)。倒置顯微鏡觀察CMECs細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)，檢測(cè)試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、p62及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)CMECs細(xì)胞特征性表面標(biāo)志物蛋白CD34表達(dá)。與空白組比較，模型組CMECs細(xì)胞壞死程度增加，培養(yǎng)液中LDH含量明顯增加（＜0.01），Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01，＜0.05），p62蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01），CD34蛋白紅色熒光明顯減弱；與模型組比較，丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組和3-MA自噬抑制劑組CMECs細(xì)胞壞死程度減輕，培養(yǎng)液中LDH含量明顯減少（＜0.01），Beclin 1蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01），p62、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01，＜0.05），CD34蛋白紅色熒光明顯增強(qiáng)。丹參通絡(luò)解毒湯能適度抑制缺氧/復(fù)氧CMECs細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)血管生成，達(dá)到保護(hù)CMECs細(xì)胞的目的。

丹參通絡(luò)解毒湯；心肌缺血再灌注損傷；心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞；自噬；血管生成；大鼠

急性心肌損傷（acute myocardial injury，AMI）后缺血組織血管驟然再通與血液復(fù)流，將進(jìn)一步加重病理?yè)p傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。目前，再灌注引起血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能異常、炎癥因子激活及自噬性死亡等MIRI已成為心血管領(lǐng)域研究熱點(diǎn)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，再灌注可誘發(fā)心肌細(xì)胞過(guò)度自噬，使凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，增加細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大梗死面積，降低左室射血分?jǐn)?shù)，影響左室重構(gòu)[3]。研究表明，心肌缺血早期，自噬被激活，促進(jìn)血管生成；再灌注期，自噬進(jìn)一步加劇反而抑制血管生成，心肌損傷加重[4]。目前，如何運(yùn)用中醫(yī)藥達(dá)到治療性血管生成作用，促進(jìn)藥物建立側(cè)支循環(huán)即實(shí)現(xiàn)“藥物搭橋”已成為治療心肌缺血的新方向。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參通絡(luò)解毒湯能適度抑制MIRI引起的過(guò)度自噬以減輕心肌損傷，并可聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bEGF），促進(jìn)血管生成以保護(hù)受損心肌[5-6]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，觀察丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）自噬及血管生成相關(guān)因子的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物

大鼠CMECs購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（湘）2016-0002。常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥物

丹參通絡(luò)解毒湯（丹參15 g，生地黃15 g，金銀花10 g，連翹10 g，玄參15 g，麥冬12 g，黃連6 g，梔子15 g，檀香10 g，黃芪30 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，紅花10 g，水蛭6 g），飲片購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，常規(guī)煎煮2次，合并2次藥液，濃縮為含原藥材4 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

大鼠CMECs完全培養(yǎng)基（普諾賽，貨號(hào)CM-R135），0.25%胰酶-EDTA（Gibco，貨號(hào)25200056），CCK8試劑盒（Biosharp，貨號(hào)BS350B），PBS（Solarbio，貨號(hào)blz-0099），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)GWB-4F1107），RIPA裂解液（武漢皮諾飛生物科技有限公司，貨號(hào)P2002），3-甲基腺嘌呤（3-MA，HyClone，貨號(hào)S24823-1g），胎牛血清（FBS，HyClone，貨號(hào)SH30109.03），青鏈霉素混合液（上海吉至生化有限公司，貨號(hào)AP1400-100），VEGF抗體（Sino Biological，貨號(hào)101465-MM02），Beclin 1抗體（Sino Biological，貨號(hào)201473-T38），p62抗體（Fine Test，貨號(hào)FNab06087），HRP goat anti-mouse IgG（Proteintech，貨號(hào)SA00001-1），HRP goat anti-rabbit IgG（Proteintech，貨號(hào)SA00001-2）。CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo），倒置顯微鏡（日本Olympus公司，CKX53），-70 ℃低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher），低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf，5427R），恒溫水浴箱（上海精宏，DK-SD），酶標(biāo)儀（Molecular Devices，HBS- 1096A），倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）。

1.4 藥物血清制備

將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照血清組和藥物血清組，各15只。藥物劑量按人（60 kg）與動(dòng)物體表面積換算，灌胃丹參通絡(luò)解毒湯藥液3.9 mL/（kg?d）[相當(dāng)于原藥材15.6 g/（kg?d）]，對(duì)照血清組給予等體積蒸餾水灌胃，2次/d，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈插管，用無(wú)菌不抗凝管采血，室溫靜置2 h，3000 r/min離心15 min，取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，再56 ℃滅活30 min，分裝，-20 ℃冰箱中保存，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的藥物血清備用。

1.5 缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型建立

將CMECs加入含1%青鏈素雙抗混合液及10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)80%～90%，棄去原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，替換成無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，氣體體積分?jǐn)?shù)為94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，再?gòu)?fù)氧并換正常DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h。

1.6 CCK8法篩選藥物血清最佳實(shí)驗(yàn)濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CMECs，加胰酶消化，加培養(yǎng)液終止消化并離心，棄上清液，PBS重懸，制成密度為5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，貼壁后配制體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%藥物血清，空白組加等量含正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔加100 μL完全培養(yǎng)基和CCK8溶液10 μL，避光37 ℃孵育2 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)吸光度（OD值），計(jì)算最佳藥物血清濃度。

1.7 分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CMECs隨機(jī)分為空白組、模型組、丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組（藥物血清組）、3-MA自噬抑制劑組（3-MA組）?？瞻捉M用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 h；模型組用低糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、94%N2、1%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧2 h，換正常DMEM培養(yǎng)基再給氧3 h；藥物血清組按模型組方法造模后，加最佳藥物血清濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；3-MA組加3-MA（10 mmol/L）預(yù)培養(yǎng)30 min后造模。

1.8 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡觀察CMECs生長(zhǎng)及形態(tài)變化。

1.9 比色光度法檢測(cè)乳酸脫氫酶含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，胰酶消化，離心后取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定LDH含量。

1.10 Western blot檢測(cè)Beclin 1、p62及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白表達(dá)

PBS洗滌細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度并定量；蛋白樣品上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，迅速置于TBS液，室溫含5%脫脂奶粉TBST中封閉1 h；洗滌后用一抗、二抗按相應(yīng)比例稀釋后孵育，TBST洗3次，每次10 min，用ECL-Plus試劑發(fā)光，Image J 6.0分析蛋白表達(dá)條帶。

1.11 免疫熒光檢測(cè)CD34蛋白表達(dá)

細(xì)胞胰酶消化制成細(xì)胞懸液，1×105個(gè)/孔接種于6孔板，按“1.7”項(xiàng)下方法培養(yǎng)。PBS洗3次，每次4 min；4%多聚甲醛固定20 min；PBS洗3次，每次5 min；常溫滴加200 μL FBS，室溫孵育封閉1 h；滴加50～100 μL一抗，室溫避光孵育過(guò)夜，PBS洗3次，每次4 min；滴加50～100 μL二抗，室溫避光孵育1 h；最后滴加50～100 μL DAPI染核，室溫避光孵育10 min。同時(shí)做同型對(duì)照，不加一抗，步驟同前，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

空白組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或多角形，貼壁生長(zhǎng)良好，折光性強(qiáng)，懸浮細(xì)胞極少；模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，并有大量懸浮細(xì)胞，細(xì)胞間隙增大，折光性減弱，胞質(zhì)中有空泡和顆粒；藥物血清組及3-MA組細(xì)胞大部分形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞間隙不明顯，折光性良好，細(xì)胞質(zhì)可見少量零散顆粒，有少量懸浮細(xì)胞。

2.2 藥物血清最佳實(shí)驗(yàn)濃度篩選結(jié)果

丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清干預(yù)后，與空白組比較，不同濃度藥物血清對(duì)CMECs細(xì)胞活力有明顯影響（＜0.05），其中15%藥物血清效果最佳，見表1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用15%藥物血清。

表1 不同濃度丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清對(duì)大鼠CMECs細(xì)胞活力的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05，**＜0.01

2.3 丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)模型細(xì)胞乳酸脫氫酶含量的影響

與空白組比較，模型組、藥物血清組、3-MA組CMECs LDH含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，藥物血清組和3-MA組LDH含量明顯減少（＜0.01）。結(jié)果見圖1。

2.4 丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)模型細(xì)胞Beclin 1、p62、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組CMECs Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高，p62蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，藥物血清組、3-MA組CMECs Beclin 1蛋白表達(dá)明顯降低，p62、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01，＜0.05）。結(jié)果見圖2。

2.5 丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)模型細(xì)胞CD34表達(dá)的影響

免疫熒光染色顯示，細(xì)胞核染成藍(lán)色熒光，CD34著色于細(xì)胞質(zhì)，CD34陽(yáng)性表達(dá)為紅色熒光。與空白組比較，模型組CMECs熒光強(qiáng)度減弱，CD34蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，藥物血清組和3-MA組CMECs紅色熒光明顯增強(qiáng)，CD34蛋白表達(dá)明顯升高。結(jié)果見圖3。

注：A.空白組；B.模型組；C.藥物血清組；D. 3-MA組；與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

注：A.空白組；B.模型組；C.藥物血清組；D. 3-MA組；與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

圖3 各組大鼠CMECs CD34蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光，×200）

3 討論

MIRI屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，總體呈氣陰虧虛、熱毒血瘀、心脈受損之本虛標(biāo)實(shí)之證。本研究針對(duì)復(fù)雜病機(jī)，發(fā)揮中藥多靶點(diǎn)、多向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，取《溫病條辨》清營(yíng)湯與《時(shí)方歌括》丹參飲合方加減組成丹參通絡(luò)解毒湯，該方損益結(jié)合、標(biāo)本兼治，主以治標(biāo)，共奏涼營(yíng)解毒、活血通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰之效[7]。

心肌細(xì)胞受損或壞死時(shí)，LDH從受損細(xì)胞中釋放進(jìn)入血液，作為檢測(cè)心肌細(xì)胞損傷的常規(guī)指標(biāo)，LDH具有較強(qiáng)的特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組CMECs明顯受損，丹參通絡(luò)解毒湯藥物血清組缺氧/復(fù)氧后CMECs LDH含量明顯減少，提示本方可改善缺氧/復(fù)氧后的CMECs損傷。

自噬是維持真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制之一，常態(tài)下，自噬保持正?；蛏愿咚?，呈適度狀態(tài)，以調(diào)節(jié)、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能[8]。應(yīng)激狀態(tài)下，自噬能將功能異常的蛋白質(zhì)和受損或老化細(xì)胞器降解成氨基酸、核苷酸等[9]。在感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等情況下，誘發(fā)細(xì)胞過(guò)度自噬進(jìn)而損傷細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡[10-11]。自噬啟動(dòng)因子Beclin 1與Bcl-2/Bcl-XL解離并激活Ⅲ型PI3K是啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵。相較于心肌缺血期，Beclin l蛋白在MIRI期大量增加，阻礙自噬體的清除，加重心肌細(xì)胞的凋亡[12]。一般情況下，p62蛋白水平高低與自噬活性成反比，即自噬減弱而p62表達(dá)升高，p62蛋白增多表明自噬/溶酶體降解途徑受到抑制[13]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物血清組和3-MA組較模型組均能下調(diào)自噬蛋白Beclin 1的表達(dá)，上調(diào)自噬蛋白p62的表達(dá)，在一定程度上可抑制CMECs自噬。

血管生成是在促血管生成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用下，使血管內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖、遷移形成新的血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜過(guò)程。缺血缺氧時(shí)，機(jī)體應(yīng)激性地通過(guò)促血管生成因子建立側(cè)支循環(huán)以改善心肌損傷[14]。研究表明，中藥能加速代償循環(huán)血液供應(yīng)，增加微血管密度數(shù)量，改善梗死區(qū)缺血缺氧，減少心肌細(xì)胞損傷與凋亡，縮小梗死面積，改善心功能[15-16]。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。在低氧環(huán)境下，VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，引起受體的自身磷酸化，從而激活有絲分裂原活化蛋白激酶，實(shí)現(xiàn)VEGF的有絲分裂原特性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生。同時(shí)VEGF明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮再生，提高血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等。CD34是主要表達(dá)在人或鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，是內(nèi)皮細(xì)胞表面特征性標(biāo)記物之一，其表達(dá)水平能較好地反映內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)，又能反映新生血管程度。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物血清組和3-MA組較模型組VEGF表達(dá)升高，且藥物血清組優(yōu)于3-MA組；免疫熒光染色顯示，藥物血清組和3-MA組較模型組CD34蛋白表達(dá)升高。

綜上，本研究結(jié)果表明，丹參通絡(luò)解毒湯能適度抑制缺氧/復(fù)氧CMECs自噬，進(jìn)而更好地促進(jìn)血管生成，達(dá)到保護(hù)CMECs的作用。

[1] DONG Q, LI J, WU Q F, et al. Blockage of transient receptor potential vanilloid 4 alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in mice[J]. Sci Rep,2017,7：42678.

[2] LU S, ZHANG Y, ZHONG S, et al. N-n-butyl haloperidol iodide protects against hypoxia/reoxygenation injury in cardiac microvascular endothelial cells by regulating the ROS/MAPK/Egr-1 pathway[J]. Front Pharmacol,2016,7：520.

[3] HAUSENLOY D J, YELLON D M. Myocardial ischemia-reperfusion injury：a neglected therapeutic target[J]. J Clin Invest,2013, 23(1)：92-100.

[4] FANG B, LI X Q, BAO N R, et al. Role of autophagy in the bimodal stage after spinal cord ischemia reperfusion injury in rats[J]. Neuro Science,2016,328：107-116.

[5] 王靜雯.丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠自噬的實(shí)驗(yàn)研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué),2019.

[6] 肖青.丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠促血管生成機(jī)制研究[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué),2018.

[7] 李鑫輝,王靜雯,肖青,等.丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者黏附分子的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2018,38(2)：136-140.

[8] SALAZAR M, CARRACEDO A, LORENTE M, et al. Cannabinoid action induces autophagy-mediated cell death through stimulation of ER stress in human glioma cells[J]. Journal of Clinical Investigation,2009,119(5)：1359-1372.

[9] 伍思霖,黃玉瑩,丁海林,等.自噬、自噬性細(xì)胞死亡與腫瘤的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2017,29(8)：763-768.

[10] ZHANG D Y, QIU W, WANG P, et al. Autophagy can alleviate severe burn-induced damage to the intestinal tract in mice[J]. Surgery, 2017,162(2)：408-417.

[11] SHENG R, QIN Z H. The divergent roles of autophagy in ischemia and preconditioning[J]. Acta Pharmacol Sin,2015,36(4)：411-420.

[12] MA X, LIU H, FOYIL S R, et al. Impaired autophagosome clearance contributes to cardiomyocyte death in ischemia/reperfusion injury[J]. Circulation,2012,125(25)：3170-3181.

[13] BEN Y A, TAJEDDINE N, TAILLER M, et al. A fluorescence microscopic and cytofluorometric system for monitoring the turnover of the autophagic substrate p62/SQSTM1[J]. Autophagy, 2011,7(8)：883-891.

[14] LIBERIS A, STANULOV G, CHAFOUZ A E, et al. Pre-eclampsia and the vascular endothelial growth factor：a new aspect[J]. Clinical and Experimental Obstetrics and Gynecology,2016,43(1)：9-13.

[15] 黃明艷,劉超,王階.活血化瘀中藥促內(nèi)皮祖細(xì)胞血管修復(fù)和新生研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2019,26(7)：141-144.

[16] 曾曉,閆喜明,趙倩.單味中藥對(duì)血管新生的促進(jìn)作用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2019,59(20)：110-112.

Effects ofDecoction on Autophagy and Angiogenesis of Cardiac Microvascular Endothelial Cells in Rats with Hypoxia/Reoxygenation

LIU Shicheng, LI Xinhui, CHEN Xin

To investigate the effects ofDecoction containing serum on autophagy and angiogenesis of cardiac microvascular endothelial cells (CMECs) in rats with hypoxia/reoxygenation (H/R); To explore the mechanism of action.H/R injury model of CMECs was established. CMECs were randomly divided into blank group, model group,Decoction containing serum group, and 3-MA autophagy inhibitor group. Except the blank group, all the other groups were cultured in low-sugar and serum-free DMEM medium, and placed in a 37 ℃, 94% N2, 1% O2, 5% CO2incubator under hypoxia for 2 h, and then replaced with normal DMEM medium. Oxygen was given for 3 hours, and then the corresponding drugs were given. The cell growth and morphology of CMECs were observed with an inverted microscope, and the activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium was detected with the detection kit. Western blot was used to detect the expressions of autophagy-related proteins Beclin 1, p62 and VEGF, and immunofluorescence was used to detect the expression of CD34, a characteristic surface marker of CMECs.Compared with the blank group, the degree of cell necrosis, the LDH content in the cultrue medium, Beclin 1 and VEGF protein expressions in the model group increased (<0.01,<0.05), while p62 protein expression decreased (<0.01), and the red fluorescence of CD34 protein was significantly reduced in the model group. Compared with the model group, the degree of cell necrosis of CMECs, the LDH content in the culture medium, Beclin 1 protein expression were significantly reduced (<0.01), while p62 and VEGF protein expression significantly increased (<0.01,<0.05), and the red fluorescence of CD34 protein was significantly increased in theDecoction containing serum group and 3-MA autophagy inhibitor group.Decoction can moderately inhibit the autophagy of H/R CMECs, so as to better promote angiogenesis and protect CMECs.

Decoction; myocardial ischemia reperfusion injury; cardiac microvascular endothelial cells; autophagy; angiogenesis; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)06-0065-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010121

國(guó)家自然科學(xué)基金（82074392）；湖南省自然科學(xué)基金（2019JJ40210）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（15A143）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃（201559、201790）；長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃（kq1706058）；全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（2019年）

李鑫輝，E-mail：2208637467@qq.com

（2020-10-12）

（2020-12-16；編輯：華強(qiáng)）