林艾和，劉海鵬，張艷嬌，黃寬，李蓉，范源，

正交試驗(yàn)優(yōu)化白花蛇舌草4種五環(huán)三萜類(lèi)成分提取工藝

林艾和1，劉海鵬2，張艷嬌1，黃寬1，李蓉1，范源1，2

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216

優(yōu)選白花蛇舌草五環(huán)三萜類(lèi)成分山楂酸（MA）、科羅索酸（CA）、齊墩果酸（OA）、熊果酸（UA）的最佳提取工藝。采用HPLC建立MA、CA、OA、UA含量測(cè)定方法，以MA、CA、OA、UA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。MA、CA、OA、UA色譜峰分離度良好，分別在0.568～3.408 μg（2＝0.999 0）、0.582～3.492 μg（2＝0.999 0）、0.488～2.928 μg（2＝0.999 9）、0.720～4.320 μg（2＝0.999 2）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為99.09%（RSD＝1.57%）、99.76%（RSD＝1.78%）、100.49%（RSD＝1.66%）、99.52%（RSD＝1.75%）。最佳提取工藝條件為：采用95%乙醇提取70 min，提取3次。本研究?jī)?yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定可行，可用于白花蛇舌草中MA、CA、OA、UA的提取。

白花蛇舌草；正交試驗(yàn)；提取工藝；山楂酸；科羅索酸；齊墩果酸；熊果酸

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Willd的干燥全草[1]，廣泛分布于我國(guó)浙江、江蘇、廣東、江西、云南等地[2]，其性寒，味苦、甘，歸胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、活血止痛、利尿消腫等功效，臨床用于治療濕熱黃疸、小便不利、咽喉腫痛、瘡癤腫痛、闌尾炎、毒蛇咬傷、盆腔炎、泌尿系感染等。白花蛇舌草主要含有多糖類(lèi)、三萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、烷烴類(lèi)、甾醇類(lèi)、環(huán)烯醚苷萜類(lèi)、生物堿等化學(xué)成分[3-5]。其中，三萜類(lèi)化合物具有抗菌、消炎、抗癌、抗突變、抗氧化等藥理作用[6-9]。白花蛇舌草中三萜類(lèi)化合物多為烏蘇烷型和齊墩果烷型，其中2組同分異構(gòu)體化合物熊果酸（ursolic acid，UA）和齊墩果酸（oleanolic acid，OA）、科羅索酸（corosoic acid，CA）和山楂酸（maslinic acid，MA）含量較高，結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似，色譜峰出峰時(shí)間接近，分離測(cè)定存在一定難度[10-14]。本研究建立白花蛇舌草中MA、CA、OA和UA的HPLC定量分析方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，為白花蛇舌草的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

YL-040S語(yǔ)路超聲波清洗機(jī)，深圳市即潔超聲科技有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，Acclaim C30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），美國(guó)Agilent公司；DFY-600搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；D2KW-D電熱恒溫水浴鍋，上海量壹科學(xué)儀器有限公司；T-1000型電子天平，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；AB265-S十萬(wàn)分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade（Shanghai）Co.LTD；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司。

白花蛇舌草（批號(hào)P20190912，安國(guó)市旭芳中藥材經(jīng)營(yíng)有限公司），經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國(guó)棟副教授鑒定為茜草科植物白花蛇舌草Willd的干燥全草。對(duì)照品MA（批號(hào)wkq18080306）、CA（批號(hào)wkq20042404）、OA（批號(hào)wkq18050212，）、UA（批號(hào)wkq20061211），純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim C30色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸水溶液（D）；梯度洗脫（0～10 min，75%B、12.5%C、12.5%D；10～20 min，70%B、15%C、15%D；20～25 min，75%B、12.5%C、12.5%D）；流速：0.1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按MA峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，分離度均大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取對(duì)照品MA 2.84 mg、CA 2.91 mg、OA 2.44 mg、UA 3.60 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇配制成MA、CA、OA、UA濃度分別為0.284、0.291、0.244、0.360 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，低溫避光保存。

2.1.3 供試品溶液制備

取白花蛇舌草樣品，粉碎，過(guò)40目篩，精密稱(chēng)定約1.0 g，置于圓底燒瓶中，進(jìn)行回流提取，提取溫度90 ℃，料液比為1∶20，設(shè)置不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及提取次數(shù)，合并提取液，過(guò)濾，濾液于60 ℃減壓回收溶劑至干，加50 mL水使混懸，用乙酸乙酯振搖萃取5次，每次50 mL，合并乙酸乙酯液，減壓回收溶液至干，殘?jiān)蛹状家浦?0 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

注：A.對(duì)照品；B.供試品；1. MA；2. CA；3. OA；4. UA

2.1.4 線性關(guān)系考察

取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，依次精密吸取2、4、6、8、10、12 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。MA回歸方程為＝457.13－168.66（2＝0.999 0），線性范圍為0.568～3.408 μg；CA回歸方程為＝1007.7－398.94（2＝0.999 0），線性范圍為0.582～3.492 μg；OA回歸方程為＝657.6－70.54（2＝0.999 9），線性范圍為0.488～2.928 μg；UA回歸方程為＝1774.9－353.47（2＝0.999 2），線性范圍為0.720～4.320 μg。

2.1.5 精密度考察

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果MA、CA、OA、UA的峰面積RSD分別為1.92%、1.95%、1.69%、1.65%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、6、8、10 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果MA、CA、OA、UA峰面積RSD分別為1.70%、1.63%、1.95%、0.61%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果MA、CA、OA、UA含量RSD分別為1.28%、1.46%、1.24%、1.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的同一批樣品（每1.0 g樣品含MA 0.893 3 mg、CA 1.736 0 mg、OA 1.196 6 mg、UA 3.487 1 mg）粉末6份，每份精密稱(chēng)取1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，加入約等量MA、CA、OA、UA對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白花蛇舌草中MA、CA、OA、UA加樣回收率試驗(yàn)

成分取樣量 /g樣品中含量/mg加入量 /mg測(cè)得量 /mg回收率 /%平均回收率/%RSD /% MA1.013 70.850 40.927 41.792 3100.82 99.091.57 1.002 70.923 20.922 11.802 8 97.70 1.033 60.893 30.892 51.785 5 99.98 1.028 10.879 40.910 41.792 4100.15 1.047 70.913 20.905 11.802 1 99.11 1.029 40.925 00.872 31.739 6 96.79 CA1.014 01.685 61.745 53.387 6 98.73 99.761.78 1.017 21.703 11.694 23.325 9 97.90 1.068 21.736 01.727 13.502 8101.15 1.023 21.724 31.680 63.346 3 98.28 1.053 41.690 81.703 33.476 0102.41 1.058 11.783 61.698 83.485 2100.08 OA1.005 21.208 41.170 62.451 3103.04100.491.66 1.017 81.170 51.209 12.380 5100.04 1.028 91.196 61.217 92.377 3 98.46 1.085 71.194 11.164 52.385 3101.13 1.047 41.238 21.185 92.400 6 99.03 1.022 61.214 91.230 12.475 7101.26 UA1.039 73.301 63.597 86.834 7 99.0699.521.75 1.003 73.472 83.329 56.801 9 99.99 1.033 53.487 13.502 16.890 2 98.58 1.069 13.610 93.593 76.991 6 97.04 1.029 63.387 23.370 16.771 2100.21 1.002 33.602 13.580 37.342 3102.23

2.2 單因素試驗(yàn)

采用加熱回流法提取白花蛇舌草中MA、CA、OA、UA。按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)指標(biāo)成分含量（mg/g）的影響。指標(biāo)成分含量（mg/g）＝供試品峰面積×對(duì)照品濃度（mg/mL）÷對(duì)照品峰面積。

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

固定提取時(shí)間為70 min、提取次數(shù)為1次，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（65%、75%、85%、95%）對(duì)MA、CA、OA、UA提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，MA、CA、OA、UA含量逐漸升高。綜合考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)白花蛇舌草MA、CA、OA、UA提取效果的影響

2.2.2 提取時(shí)間

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、提取次數(shù)為1次，考察不同提取時(shí)間（50、70、90、110、130 min）對(duì)MA、CA、OA、UA提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。MA含量在提取50～70 min增加，70～130 min減少；CA含量在提取50～130 min逐漸增加；OA含量在提取50～70 min增加，70～130 min減少；UA含量在提取50～70 min增加，此后較70 min均減少。綜合考慮，選擇提取時(shí)間為70 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)白花蛇舌草MA、CA、OA、UA提取效果的影響

2.2.3 提取次數(shù)

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、提取時(shí)間為70 min，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)MA、CA、OA、UA提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。MA、OA含量隨提取次數(shù)增加而增大；CA、UA含量在提取3次時(shí)最高，提取4次時(shí)減少。綜合考慮，選擇提取次數(shù)為3次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)白花蛇舌草MA、CA、OA、UA提取效果的影響

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)因素與水平

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，考察各因素對(duì)MA、CA、OA、UA含量的影響，因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

水平乙醇體積分?jǐn)?shù)/%A提取時(shí)間/minB提取次數(shù)C 175 701 285 902 3951103

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

分別精密稱(chēng)取白花蛇舌草粉末1.0 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算MA、CA、OA、UA含量，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3～表7。

表3 白花蛇舌草中4種成分L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果（mg/g）

試驗(yàn)號(hào)ABCMACAOAUA 11110.5020.7280.7102.344 21220.4230.6700.6302.173 31330.3440.9900.7492.673 42120.6071.1930.9592.906 52230.5941.2430.8341.705 62310.2490.7110.4611.277 73130.9261.7031.2533.493 83210.5461.1180.5681.115 93320.4360.8130.5891.075 K1（MA）0.4230.6780.432 K1（CA）0.7961.2080.852 K1（OA）0.6960.9740.580 K1（UA）2.3972.9141.579 K2（MA）0.4830.5210.489 K2（CA）1.0491.0100.892 K2（OA）0.7510.6770.726 K2（UA）1.9631.6642.051 K3（MA）0.6360.3430.621 K3（CA）1.2110.8381.312 K3（OA）0.8030.6000.945 K3（UA）1.8941.6752.624 R（MA）0.2130.3350.189 R（CA）0.4150.3700.460 R（OA）0.1070.3740.365 R（UA）0.5031.2501.045

表4 MA含量正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.07221.1256.940 B0.16922.6416.940P＜0.05 C0.05620.8756.940 誤差0.1304

表5 CA含量正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.26321.27719.000 B0.20621.00019.000 C0.38921.88819.000 誤差0.2102

表6 OA含量正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.0172 1.00019.000 B0.234213.76519.000P＜0.05 C0.203211.94119.000P＜0.05 誤差0.0202

表7 UA含量正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性 A0.44521.00019.000 B3.09926.96419.000P＜0.05 C1.64323.69219.000 誤差0.4502

以MA含量為指標(biāo)，3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響為B＞A＞C；以CA含量為指標(biāo)，3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響為C＞A＞B；以O(shè)A含量為指標(biāo)，3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響為B＞C＞A；以UA含量為指標(biāo)，3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響為B＞C＞A。以A、C為誤差列分別對(duì)MA含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果B因素對(duì)MA含量影響顯著；以B為誤差列對(duì)CA含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果A、B、C因素均對(duì)CA含量無(wú)顯著影響；以A為誤差列對(duì)OA含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果B、C因素對(duì)OA含量影響顯著；以A為誤差列對(duì)UA含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果B因素對(duì)UA含量影響顯著。

提取工藝A3B1C3的提取效果最佳，在此條件下MA、CA、OA和UA含量分別為0.926、1.703、1.253、3.493 mg/g。綜合考慮，最佳提取工藝組合為A3B1C3，即95%乙醇提取70 min，提取3次。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

平行稱(chēng)取樣品粗粉3份，每份1.0 g，精密稱(chēng)定，按優(yōu)選工藝進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表8。表明正交試驗(yàn)優(yōu)選的工藝條件較好，合理可行。

表8 白花蛇舌草中4種成分提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（mg/g）

編號(hào)MACA OA UA 10.9311.6691.2743.527 20.8951.6711.2163.412 30.9181.7321.2723.528 平均含量0.9151.6911.2543.489 RSD/%1.992.122.631.91

3 討論

MA、CA、OA和UA均為白花蛇舌草中的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，MA與CA、OA與UA分別為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相似，MA是OA的衍生物，CA是UA的衍生物。這2組同分異構(gòu)體在中性流動(dòng)相中可解離，常規(guī)色譜條件很難使其達(dá)到基線分離。本研究在多次預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)以甲醇、乙腈、磷酸共同作為流動(dòng)相使用能很好提高其分離度，改善色譜峰的峰形，出峰時(shí)間適合。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，調(diào)整甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液三者的比例，最終以甲醇（B）-乙腈（C）- 0.1%磷酸水溶液（D）為流動(dòng)相梯度洗脫，2組同分異構(gòu)體的分離度均大于1.5，達(dá)到了檢測(cè)要求。進(jìn)而以MA、CA、OA和UA含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)影響提取效果的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行分析，得到最佳提取工藝參數(shù)。

白花蛇舌草臨床應(yīng)用廣泛，但現(xiàn)有的質(zhì)量控制研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，其優(yōu)化提取工藝多以UA為評(píng)價(jià)指標(biāo)。OA是UA同分異構(gòu)體，MA為OA衍生物，CA為UA衍生物且二者含量較高，僅以UA為檢測(cè)指標(biāo)存在局限性，難以較好優(yōu)化其提取工藝。本試驗(yàn)以MA、CA、OA、UA為指標(biāo)成分，指標(biāo)選擇更為合理，結(jié)果更準(zhǔn)確，更適用于白花蛇舌草有效成分的提取工藝優(yōu)化。

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Optimization of Extraction Technology of Four Pentacyclic Triterpenes fromby Orthogonal Experiment

LIN Aihe1, LIU Haipeng2, ZHANG Yanjiao1, HUANG Kuan1, LI Rong1, FAN Yuan1,2

To optimize the extraction technology of pentacyclic triterpenes maslinic acid (MA), corosoic acid (CA), oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) from.A method for the determination of MA, CA, OA and UA was established by HPLC. The contents of MA, CA, OA and UA were set as evaluation indexes, and the effects of ethanol volume fraction, extraction time and extraction times on the extraction efficiency were investigated by single factor and orthogonal experiment.MA, CA, OA, UA had good resolution of chromatographic peak, showing good linear relationships in the ranges of 0.568–3.408 μg (2=0.999 0), 0.582–3.492 μg (2=0.999 0), 0.488–2.928 μg (2=0.999 9), 0.720–4.320 μg (2=0.999 2), respectively. The recovery rates were 99.09% (RSD=1.57%), 99.76% (RSD=1.78%), 100.49% (RSD=1.66%) and 99.52% (RSD=1.75%), respectively. The optimal extraction technology conditions were: 95% ethanol extraction for 70 min, 3 times for extraction.The optimal extraction technology is reasonable, stable and feasible., and can be used to extract MA, CA, OA and UA from.

; orthogonal experiment; extraction technology; maslinic acid; corosoic acid; oleanolic acid; ursolic acid

R284.2

A

1005-5304(2021)06-0083-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010251

云南省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)計(jì)劃（2019－2022年）

范源，E-mail：1647909799@qq.com

（2020-10-19）

（2020-11-30；編輯：陳靜）