康甲超，趙盼，蒙潔，陳冬梅，王勇，段永強，田一虹，王晶

基于lncRNA-mRNA網(wǎng)絡的黨參保護衰老小鼠胰腺作用機制研究

康甲超1，趙盼1，蒙潔1，陳冬梅1，王勇1，段永強1，田一虹1，王晶1，2

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

基于lncRNA-mRNA網(wǎng)絡探討黨參水提物對衰老小鼠胰腺的保護作用及分子機制。采用頸背部皮下注射D-半乳糖溶液制備衰老小鼠模型。將SPF級昆明種小鼠隨機分為正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組，各給藥組給予相應劑量藥液灌胃，連續(xù)42 d。HE染色觀察胰腺組織形態(tài)；篩選差異基因進行GO、KEGG通路分析；選取衰老后和黨參干預后共同變化基因構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡；采用RT-qPCR驗證網(wǎng)絡中關(guān)鍵基因。模型組小鼠胰腺組織形態(tài)明顯異常，黨參低、中、高劑量組小鼠胰腺組織形態(tài)均有不同程度改善，黨參高劑量組改善最明顯；芯片聚類分析顯示，衰老后和高劑量黨參干預后lncRNAs和mRNAs發(fā)生明顯變化；生物信息學分析顯示，衰老后和黨參干預后差異基因相同GO條目有脂肪酸代謝和線粒體，相同KEGG通路有代謝通路；對lncRNA-mRNA網(wǎng)絡中關(guān)鍵基因Eci1、Dpep1、Serpini2進行RT-qPCR驗證，其結(jié)果與基因芯片分析一致。lncRNA-mRNA網(wǎng)絡在黨參保護衰老小鼠胰腺中發(fā)揮重要作用。

黨參；D-半乳糖；衰老小鼠；基因芯片

衰老是一種以累積退化性損傷為特征的過程，伴隨多器官功能衰退，最終導致機體死亡。胰腺是機體重要的消化腺，兼有內(nèi)分泌與外分泌雙重功能，在維持機體糖代謝和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等方面發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，胰腺隨著年齡增長發(fā)生衰老變化，主要表現(xiàn)在組織結(jié)構(gòu)退變，內(nèi)分泌、外分泌功能下降和各種胰腺疾病發(fā)生等方面[2-4]。黨參具有調(diào)節(jié)血糖、抗缺氧、抗應激、抗疲勞、延緩衰老等藥理作用[5]。課題組前期研究表明，黨參可保護D-半乳糖致衰老模型小鼠肺、胸腺、腎等多器官[6-7]。迄今有關(guān)黨參保護衰老小鼠胰腺組織作用機制研究尚未見報道。因此，本研究采用基因芯片技術(shù)，利用生物信息學方法分析衰老后和高劑量黨參干預后的差異基因，探討黨參保護衰老小鼠胰腺的作用靶標和可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠100只，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量（18±2）g，甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物房，室溫20～25 ℃，自然光照，自由攝食飲水。所有實驗程序和方案均按照甘肅中醫(yī)藥大學動物倫理委員會指導方針執(zhí)行（編號2017-106）。

1.2 藥物及制備

黨參采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學中藥資源教研室杜弢教授鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，過濾，濃縮成含原藥材0.5 g/mL水煎劑，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

D-半乳糖，美國Sigma公司，批號24895207，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L溶液；Trizol試劑，Invitrogen公司，貨號15596-026；NucleoSpin?RNA Clean-up試劑盒，MACHEREY-NAGEL公司，貨號740948.250。光學顯微鏡，日本奧林巴斯，型號CX31；石蠟切片機，德國Leica公司，型號RM2125；安捷倫芯片掃描儀，美國安捷倫，型號G2565CA。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

將100只小鼠隨機分為正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組，每組20只，雌雄各半。參照文獻[8]方法采用頸背部皮下注射D-半乳糖溶液制備小鼠衰老模型，給藥劑量為50 g/（L?d），注射量為0.025 mL/g。造模同時黨參低、中、高劑量（5、10、15 g/kg）組分別給予黨參藥液灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積0.025 mL/g，每日1次，連續(xù)42 d。

2.2 HE染色

末次給藥2 h后，10%水合氯醛（0.004 mL/g）腹腔注射麻醉，頸椎脫臼法處死小鼠。取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚約3 μm）。脫蠟，HE染色，封片，鏡下觀察。

2.3 RNA提取、檢測及數(shù)據(jù)預處理

采用Trizol提取正常對照組、模型組和黨參高劑量組小鼠胰腺組織總RNA。采用NucleoSpin?RNAClean-up試劑盒對總RNA進行過柱純化。利用Capital Bio Technology Mouse Lnc RNAArray v1，4×180K芯片，檢測小鼠胰腺組織基因表達譜。用Agilent Feature Extraction（v10.7）軟件分析雜交圖片，并提取數(shù)據(jù)。以＜0.05、|FC|≥2為篩選標準，用Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。

2.4 生物信息學分析

為研究差異表達mRNAs生物學功能，采用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進行差異mRNAs GO富集分析，?。?.05的條目，包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）。采用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）進行差異mRNAs KEGG通路分析，?。?.05的前10個通路。采用Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/Venn/）取衰老后和高劑量黨參干預后lncRNAs及mRNAs的交集，計算兩兩間Pearson相關(guān)系數(shù)（R），以|R|＞0.5、＜0.05為篩選標準，采用Cytoscape3.6.1分析軟件構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡。

2.5 RT-qPCR檢測

根據(jù)HE染色結(jié)果，采用Trizol試劑提取正常對照組、模型組和黨參高劑量組總RNA，用Qubit法定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，RT-qPCR檢測反轉(zhuǎn)錄cDNA模板。lncRNA和mRNA表達量均以GAPDH為內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp GAPDHF：GTTGTCTCCTGCGACTTCA182 R：TGGTCCAGGGTTTCTTACTC Dpep1F：AGCTCAGGGAAGACTGGACAAG 57 R：GGGTGTGGTTCTGCACGGAC Eci1F：AGGTGGGAGTGGTGGATGAG 98 R：CCGAGAATGGTCTGGGATAGC Serpini2F：CCACGGAAGACACGAGCATC 58 R：CGGACGTGAGGAGCAGTAAC

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 HE染色結(jié)果

正常對照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)正常，胰島細胞結(jié)構(gòu)正常，排列緊密；模型組小鼠胰島細胞排列極為疏松，體積增大，細胞核呈橢圓形，腺泡細胞體積縮小，且大小不一，排列不規(guī)則；黨參低劑量組小鼠胰島細胞排列疏松，胞核圓形，體積增大，腺泡細胞體積縮小；黨參中劑量組小鼠胰島細胞形態(tài)正常，腺泡細胞體積較?。稽h參高劑量組小鼠胰島細胞呈團狀，分布規(guī)則，腺泡細胞大致正常。見圖1。

4.2 胰腺組織lncRNA、mRNA差異基因篩選

以|FC|≥2、＜0.05為條件篩選差異基因，衰老后差異基因lncRNAs為332個，其中上調(diào)194個，下調(diào)138個；差異基因mRNAs為346個，其中上調(diào)272個，下調(diào)74個。高劑量黨參干預后，差異基因lncRNAs為48個，其中上調(diào)22個，下調(diào)26個；差異基因mRNAs總數(shù)為209個，其中上調(diào)127個，下調(diào)82個。見圖2。

4.3 差異基因功能和通路富集分析結(jié)果

對衰老后和高劑量黨參干預后差異基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)相同GO條目有脂肪酸代謝和線粒體，結(jié)果見圖3、圖4。對衰老后和高劑量黨參干預后差異基因進行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)相同KEGG通路有代謝通路，結(jié)果見圖5、圖6。

4.4 構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡

根據(jù)HE染色結(jié)果，高劑量黨參對衰老小鼠胰腺組織保護作用最為顯著，所以本研究取衰老后和高劑量黨參干預后差異基因交集，得到5個lncRNAs、34個mRNAs，見圖7、圖8。取交集lncRNAs和mRNAs構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，包括5個lncRNAs（2個上調(diào)、3個下調(diào)）和34個mRNAs（12個上調(diào)、22個下調(diào)），共167個相互作用關(guān)系，見圖9。

注：箭頭所指為胰島

注：綠色表示下調(diào)，紅色表示上調(diào)

圖3 衰老后差異基因GO功能分析

圖4 高劑量黨參干預后差異基因GO功能分析

圖5 衰老后差異基因KEGG通路分析

圖6 高劑量黨參干預后差異基因KEGG通路分析

圖7 衰老后和高劑量黨參干預后lncRNAs交集

圖8 衰老后和高劑量黨參干預后mRNAs交集

4.5 RT-qPCR驗證結(jié)果

根據(jù)lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡中節(jié)點degree＞4和芯片分析（|FC|≥2），采用RT-qPCR方法檢測3個mRNAs（Eci1、Dpep1、Serpini2）。Dpep1和Eci1在衰老后胰腺組織中表達上調(diào)，高劑量黨參干預后表達下

調(diào)（＜0.05，＜0.01）；Serpini2在衰老后胰腺組織中表達下調(diào)，高劑量黨參干預后表達上調(diào)（＜0.05），見圖10。與基因芯片分析結(jié)果一致。

注：箭頭代表lncRNA，圓圈代表mRNA，橘黃色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

5 討論

衰老的胰腺組織整體發(fā)生變化，如胰腺腺泡縮小，胰島β細胞數(shù)量減少[9]，這與本研究中胰腺組織HE染色結(jié)果一致。低、中、高劑量黨參干預后衰老小鼠胰腺組織形態(tài)均有好轉(zhuǎn)，高劑量黨參組抗衰老效果最顯著，提示黨參可通過保護胰腺組織結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮抗衰老作用。研究發(fā)現(xiàn)，黨參可明顯改善糖尿病小鼠胰島素抵抗，有效改善糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥[10]。通過對衰老后和高劑量黨參干預后差異基因GO富集分析，發(fā)現(xiàn)二者具有相同GO條目，在生物過程有脂肪酸代謝，在細胞成分有線粒體。研究表明，隨著年齡增長，血漿三酰甘油代謝改變和脂肪酸分配改變是引起衰老的主要原因之一[11]。胰島β細胞衰老不僅與年齡有關(guān)，還與肥胖和脂代謝異常使體內(nèi)衰老的細胞數(shù)量增加有關(guān)[12]。線粒體是細胞的能量代謝工廠，對維持細胞的正常新陳代謝起著重要作用，其質(zhì)量、活性改變與細胞衰老密切相關(guān)[13]。線粒體功能紊亂是真核生物衰老的標志[14]。胰島β細胞衰老影響細胞功能的分子機制可能與線粒體DNA衰老機制有關(guān)[15]。通過對衰老后和高劑量黨參干預后差異基因KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)二者相同的KEGG通路有代謝通路。機體的衰老必然伴隨著代謝改變，黨參對小鼠體內(nèi)代謝的影響可能與通過影響改變內(nèi)源性代謝物的能量代謝途徑相關(guān)[16]。

lncRNAs可與蛋白直接相互作用，并在多個層次調(diào)節(jié)靶基因的表達或相互作用蛋白的穩(wěn)定性、活性等，從而參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程[17]。Morán等[18]研究人類胰島β細胞lncRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)1128個胰島特異性lncRNA，且多數(shù)與胰島分化過程有關(guān)。本研究通過lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡構(gòu)建和RT-qPCR驗證，證實Eci1、Dpep1和Serpini2與衰老和黨參干預之間的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，Eci1具有分解不飽和脂肪酸的功能，衰老導致體內(nèi)代謝活躍，隨著年齡的增長，不飽和脂肪酸的比例逐漸下降[19-20]。衰老后Eci1基因表達上調(diào)，高劑量黨參干預后表達下調(diào)，黨參可能通過影響Eci1的表達起到抗衰老作用，其機制與降低不飽和脂肪酸代謝有關(guān)。Dpep1編碼酶為二肽酶1，是一種鋅依賴性金屬蛋白酶，在谷胱甘肽代謝中起著重要作用。Dpep1可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮腫瘤促進作用，具有促進腫瘤細胞生長、抑制腫瘤細胞凋亡和調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導的生理作用[21]。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，具有保護細胞、抗氧化、抗衰老等作用[22]。Dpep1在衰老后表達上調(diào)，高劑量黨參干預后表達下調(diào)，黨參可能通過影響Dpep1的表達起到抗衰老作用，其機制與影響谷胱甘肽和抑制腫瘤發(fā)生有關(guān)。Serpini2是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的46 kD成員?；虮磉_譜顯示，Serpini2在胰腺中占主導地位。在小鼠中表達下調(diào)時與腺泡細胞凋亡和胰腺功能不全相關(guān)，Serpini2能直接抑制胰腺酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶，保護胰腺細胞免受各種酶原過早激活被水解[23]。衰老后Serpini2基因表達下調(diào)，高劑量黨參干預后表達上調(diào)，黨參可能通過影響Serpini2的表達起到抗衰老作用，其機制與保護胰腺組織免受各種酶原水解有關(guān)。

綜上，黨參可改善衰老小鼠胰腺組織形態(tài)。通過GO功能分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，黨參通過影響脂肪酸代謝、線粒體、代謝通路等發(fā)揮抗衰老作用。lncRNA-mRNA網(wǎng)絡構(gòu)建和RT-qPCR驗證表明，Eci1、Dpep1和Serpini2與衰老及黨參抗衰老相關(guān)。本研究為黨參藥用開發(fā)提供了一定的依據(jù)。

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Study on Mechanism of Codonopsis Radix in Protecting the Pancreas of Aging Mice Based on lncRNA-mRNA Network

KANG Jiachao1, ZHAO Pan1, MENG Jie1, CHEN Dongmei1, WANG Yong1,DUAN Yongqiang1, TIAN Yihong1, WANG Jing1,2

To explore the protective effect and molecular mechanism of Codonopsis Radix on the pancreas of D-galactose-induced aging mice based on the lncRNA-mRNA network.The aging model was prepared by subcutaneous injection of D-galactose solution on the back of the neck. SPF Kunming mice were randomly divided into normal control group, model group and low-, medium-, and high-dosage Codonopsis Radix groups. Each administration group was given the corresponding dosage of liquid medicine by gavage for 42 consecutive days. HE staining was used to observe the morphology of pancreas; differential genes were screened for GO analysis and KEGG pathway analysis; genes that change together after aging and after the intervention of Codonopsis Radix were selected to construct lncRNA-mRNA co-expression network; RT-qPCR was used to verify key genes in the network.The pancreatic tissue morphology of mice in the model group was obviously abnormal. After the intervention of low-, medium-, and high-dosage Codonopsis Radix, the tissue structure of the pancreas in each group was improved to different degrees, and the effect of high-dosage Codonopsis Radix group was the most significant. Microarray cluster analysis showed that lncRNAs and mRNAs changed significantly after aging and the intervention of high-dosage Codonopsis Radix. Bioinformatics analysis of different genes after aging and the intervention of Codonopsis Radix, the same GO entries had fatty acid metabolism and mitochondria, and the same KEGG pathway had matabolic pathways. The key genes Eci1, Dpep1, and Serpini2 in the lncRNA-mRNA network were verified by RT-qPCR, and the results were consistent with the gene chip.The lncRNA-mRNA network plays an important role in the protection of Codonopsis Radix on pancreas of aging mice

Codonopsis Radix; D-galactose; aging mice; gene chip

R285.5

A

1005-5304(2021)06-0059-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202010275

國家自然科學基金（82060829、81760835）；甘肅省高等學?？茖W研究一般項目（2018A-052）；甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃項目（GSWSKY2017-27）

王晶，E-mail：jwang_2017@hotmail.com

（2020-10-19）

（2020-11-14；編輯：華強）