劉姝睿，吳雪娥，王遠鵬

（廈門大學化學化工學院化學工程與生物工程系，福建廈門361005）

引 言

微生物胞外電子傳遞（extracellular electron transfer，EET）是電活性微生物通過特定的呼吸鏈將胞內(nèi)氧化電子供體產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移到胞外電子受體，實現(xiàn)電子受體還原的同時維持微生物自身生長的過程[1-2]。該現(xiàn)象于1987 年由Lovley 等[3]發(fā)現(xiàn)，此后EET 受到了眾多科研工作者的關注?；谶@種能力，EET在清潔電力生產(chǎn)、污水處理、生物修復、生物傳感、高能燃料轉(zhuǎn)化合成等方面具有重要的應用潛力和廣闊的發(fā)展遠景[4-5]。然而，現(xiàn)階段電活性微生物和電子受體之間相對低效的電子傳遞是影響EET在實際中應用的關鍵因素。因此開發(fā)EET效率的改善手段，研究其傳遞機理、影響因素及應用前景研究具有重要現(xiàn)實意義。

目前，強化微生物EET 的手段主要是通過內(nèi)部遺傳改造和外部納米材料介導的兩種途徑[6-7]。對電活性微生物進行遺傳改造，主要是從以下兩大方面：一是直接增加電子傳遞相關的功能基因的表達；二是提高調(diào)節(jié)微生物胞外呼吸的蛋白活性。然而，只有少數(shù)表征良好的電活性微生物可用于遺傳改造，且EET 的機制目前尚未完全闡明，導致大多數(shù)遺傳工具無法廣泛使用，限制了遺傳改造技術的應用。隨著納米技術的進步，在生物領域顯示出了潛在的應用前景。近年來，對納米材料與微生物偶聯(lián)作用的研究日趨活躍，尤其是納米材料對EET 的作用研究廣受關注[8]。納米材料與電活性微生物主要存在電子轉(zhuǎn)移和物理接觸的聯(lián)系，納米材料介導EET 的過程是決定其應用的關鍵，因此其作用機制研究是該領域亟需解決的關鍵科學問題之一。本文將重點闡述納米材料在EET 過程中的作用，以及納米材料-電活性微生物界面構筑的研究進展，并展望這個領域今后的發(fā)展趨勢。

1 電活性微生物的EET方式

目前，電活性微生物中已發(fā)現(xiàn)的電子傳遞方式主要分為兩種：（1）直接電子傳遞（direct electron transfer，DET），通過胞外膜上的細胞色素c或納米導線將電子傳遞至胞外受體；（2）間接電子傳遞（mediated electron transfer，MET），通過電子穿梭體介導電子傳遞至胞外受體[9]。這兩種EET 方式并非相互孤立的，一種微生物可能同時具有這兩種EET模式。已鑒定的兩種電活性微生物，希瓦氏菌Shewanella oneidensisMR-1（S. oneidensis）和硫還原地桿菌Geobacter sulfurreducens（G.sulfurreducens），目前研究最為全面，它們已被用作了解其他物種同源系統(tǒng)的模式菌株[10-11]，其電子傳遞途徑如圖1所示。

1.1 直接電子傳遞

圖1 S.oneidensis和G.sulfurreducens胞外電子傳遞方式示意圖[8-9,12]Fig.1 Extracellular electron transfer model of S.oneidensis and G.sulfurreducens[8-9,12]

1.1.1 細胞色素c電活性微生物可以依靠細胞胞外膜上的細胞色素c與胞外受體之間的直接物理接觸來傳遞電子[13]。S.oneidensis中的電子傳遞途徑被研究者們稱為Mtr 途徑（metal reduction pathway），代謝過程中產(chǎn)生的電子先被細胞膜內(nèi)的細胞色素CymA 接受，再通過c型色素蛋白Fcc3和STC跨過周質(zhì)空間傳遞至MtrCAB 復合體[14]。然而，周質(zhì)空間介導電子的細胞色素并不僅限于Fcc3 和STC，Sturm等[12]證明同時敲除這兩種細胞色素蛋白表達相關基因的突變株，在經(jīng)過長時間的滯后期后仍能在檸檬酸中生長。MtrCAB 復合體負責希瓦氏菌的周質(zhì)空間和外膜表面的電子連接，其中MtrA 和MtrC 分別從周質(zhì)和細胞外側錨定在MtrB 形成的孔道內(nèi)。暴露于細胞外膜表面的MtrC 和OmcA，作為呼吸鏈末端蛋白，實現(xiàn)胞外電子受體的還原[15]。

G. sulfurreducens的EET 模 式 與S. oneidensis類似，位于內(nèi)膜與細胞質(zhì)相連的MacA 可以接受醌池傳遞出的電子，并將其轉(zhuǎn)移給周質(zhì)中的三亞鐵紅素PpcA 或PpcD，跨過周質(zhì)空間后，再將電子傳遞給外膜蛋白OMCs（包括OmcB、OmcE、OmcS 及OmcZ），最終傳遞至胞外的固體電子受體上，完成了電子的向外傳遞[16-17]。

1.1.2 納米導線 微生物納米導線（microbial nanowires）是從細胞表面延伸出長達數(shù)十微米的導電鞭毛[18]。這種導電結構可以促進生物膜內(nèi)微生物與固體電子受體的接觸，也可以加強種間微生物電子傳遞。不同種微生物之間潛在的電子傳遞機制存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，在S.oneidensis中存在兩種類型的納米導線，一種是基于導電的Ⅵ型菌毛，被認為可以通過依賴芳香氨基酸間電子躍遷的方式傳遞 電 子[19]，另 一 種 由El-Naggar 等[20]最 近 發(fā) 現(xiàn)S.oneidensis外膜與周質(zhì)空間可以向外延伸形成富含細胞色素c的膜囊泡納管，電子通過納管上的細胞色素c以躍遷方式傳遞。對于G.sulfurreducens，多數(shù)研究者也認為G.sulfurreducens可以表達多種納米導線。早期研究發(fā)現(xiàn)G.sulfurreducens鞭毛上有PliA蛋白，PliA 蛋白羧基端芳香族氨基酸π-π 軌道的重疊，使鞭毛具有與金屬相似的導電性，從而引起電子傳遞[21]。而最新的冷凍電鏡結果表明，在G.sulfurreducens的表面還存在OmcS 納米導線，OmcS納米導線中的血紅素分子連續(xù)排列，空間間距3.5～6 ?(1 ?=0.1 nm)，構成電子傳遞的通路。Pirbadian等[22]研究發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌的納米導線是其細胞膜的外突而非蛋白微絲，與地桿菌的納米導線有本質(zhì)區(qū)別。Malvankar 等[23]用靜電力顯微鏡證實了G.sulfurreducens的納米導線連接著細菌，并實現(xiàn)細菌間的電子傳遞。因此，這種優(yōu)良的導電性和特殊的結構形態(tài)顯示出納米導線機制在促進遠距離EET方面的潛力。

1.2 間接電子傳遞

間接電子傳遞是基于電子穿梭分子在電子供體和受體之間的擴散[24-25]。與整個細胞相比，這些分子具有更小的尺寸和更高的擴散，增強了它們與固體電子受體可用表面積的界面能力，從而大大提高EET 效率。研究發(fā)現(xiàn)微生物能自分泌到細胞外具有電子傳遞功能的穿梭體，如黃素類、吩嗪類等[26-27]。Brutinel等[28]證實了S.oneidensis分泌黃素類物質(zhì)作為電子穿梭體介導EET 的可能機制，如圖1所示，微生物在胞內(nèi)分解有機物所產(chǎn)生的部分黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dianucleotide，F(xiàn)AD）被轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間，然后在UshA（5'-核苷酸酶）的作用下水解為黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）和 腺 苷 一 磷 酸（adenosine monophosphate，AMP）[29]。FMN可以自由穿過外膜擴散至胞外，也或者進一步水解為核黃素（riboflavin，RF）。胞外游離態(tài)的FMNox得到來自MtrC/OmcA 的電子而被還原為FMNred，然后再通過擴散將電子傳遞至胞外電子受體緊接被氧化，以此方式來介導電活性微生物與胞外受體間的電子傳遞過程。除了微生物自分泌的小分子，天然存在或人工合成的可溶性分子也具有傳遞電子的能力，如醌類、腐殖質(zhì)等[30-31]。另外，Okamoto 等[32]研究發(fā)現(xiàn)S. oneidensis分泌的黃素，除了以游離形式存在，還可以與外膜細胞色素形成細胞色素-半醌復合物進行電子傳遞。這種復合物的氧化還原反應速率比游離形式的黃素快103～105倍。但這種結合態(tài)會隨著S. oneidensis代謝的強弱而形成與消散，調(diào)控著EET 的程度以及細胞內(nèi)代謝活動。對于這種結合形式，電子如何從復合物傳遞至電子受體，是繼續(xù)穿梭？還是直接接觸電子受體表面?zhèn)鬟f？以及這個過程對微生物的重要性如何？目前還不清楚。

2 納米材料影響EET的主要因素

電活性微生物至胞外受體的電子轉(zhuǎn)移能力是影響微生物EET 體系效率的關鍵。納米科學的快速發(fā)展對微生物與胞外受體界面修飾從而促進EET提供了重要支撐。已有研究表明，引入納米材料可以降低電子從電活性微生物到胞外受體的界面阻力，增強電子從電活性微生物到胞外受體的轉(zhuǎn)移，改善微生物的附著和生物膜的形成，并促進特定的代謝活性[33]。納米材料-電活性微生物界面電子傳遞過程受多種因素影響，如電子轉(zhuǎn)移能力、氧化還原電勢、表面結構與性質(zhì)、生物相容性、界面相互作用、微生物種類、電子受體以及外界環(huán)境等。這里主要綜述了納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力、氧化還原電勢、表面結構與性質(zhì)、生物相容性以及納米材料-微生物界面構筑對EET過程的影響。

2.1 納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力

納米材料能夠介導電活性微生物EET 與其自身電子轉(zhuǎn)移能力（導電性、表面官能團等）密切相關[34]。一般來說，納米材料的導電性越高，越可以有效地接受電子并從微生物傳遞至終端受體。碳基材料具有高的離域電子結構和載流子遷移率，并且碳基材料表面的氧化還原基團也具有輔助間接電子傳遞的效果[35]，因此常被應用于增強生物膜的導電性進而促進EET。Liang 等[36]考察了碳納米管、活性炭和柔性石墨分別作為微生物燃料電池陽極對S. oneidensisMR-1 產(chǎn)電性能影響，其中以碳納米管作為陽極的MFC 的功率密度最高，內(nèi)阻最低，分別為402 mW/m2和263 Ω。研究結果表明，相比于其他兩種碳基材料，碳納米管能夠有效地降低MFC 的陽極內(nèi)阻和歐姆內(nèi)阻。循環(huán)伏安法分析表明，碳納米管的介導使微生物EET 動力學增強，包括S.oneidensisMR-1 的外膜細胞色素OmcA 的氧化還原活性提高。除了利用納米材料本身性質(zhì)外，還可以通過引入表面缺陷和雜原子摻雜來調(diào)節(jié)納米材料的表面電荷轉(zhuǎn)移性質(zhì)。如You 等[37]使用氮原子摻雜打破碳納米管的化學惰性，在表面形成更多的缺陷，實驗剖析證實多孔納米碳材料表面基團與產(chǎn)電菌間的相互作用，有利于提高細菌胞外直接電子傳遞，進而改善MFC性能。

除了碳基納米材料，研究人員也曾利用導電聚合物（如聚吡咯[38]、聚多巴胺[39]、聚乙烯二氧噻吩[40]等）介導EET 過程，一方面降低了微生物至電極受體之間的傳質(zhì)內(nèi)阻（Rct），以獲得更高的MFC 電流輸出；另一方面同時改善了生物相容性，以達到MFC長期有效運行。金屬/金屬氧化物具有更高的導電能力或易調(diào)控的氧化還原電勢，也被引入介導EET過程。為了單一評估電子轉(zhuǎn)移能力對EET 的影響，Li等[41]將Fe(Ⅲ)作為末端電子受體，不同醌類作為介導電子轉(zhuǎn)移的氧化還原中間體，探究氧化還原中間體的電子轉(zhuǎn)移能力與EET 速率的相關性。研究發(fā)現(xiàn)Fe(Ⅲ)還原速率與中間體的電子轉(zhuǎn)移能力呈很好的線性正相關關系，相關系數(shù)高達0.933，表明納米材料介導的微生物EET 過程與納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力密不可分；同時研究者發(fā)現(xiàn)將電極作為電子受體時，EET 速率與電子轉(zhuǎn)移能力的相關系數(shù)只有0.801，這表明了納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力對EET 的影響，不僅是納米材料本身性質(zhì)，也同時受其他因素影響，如電子受體等。

2.2 納米材料的氧化還原電勢

電活性微生物通過內(nèi)源或外源電子穿梭體促進EET，主要是因為這些穿梭體具有合適的氧化還原電勢，能夠接受細胞色素c的電子變成還原態(tài)，再將其傳遞至胞外受體隨之被氧化。納米材料與微生物外膜、電子受體之間的電勢差，決定著電子傳遞反應的驅(qū)動力。 Liu 等[42]研究發(fā)現(xiàn)在G.metallireducens和G. sulfurreducens共培養(yǎng)體系中，Anthraquinone-2, 6-disulfonate（AQDS）能增強乙醇氧化和琥珀酸還原，但其無法介導G.metallireducens和Methanosarcina barkeri互營促進甲烷產(chǎn)生過程，主要因素可能是氧化還原電勢。AQDS/AHQDS 氧化還原電勢為E0= - 184 mV，可驅(qū)使延胡索酸的還原，而將CO2還原成CH4所需的電勢為E0(CO2/CH4)=- 240 mV，高于AQDS/AHQDS 氧化還原電勢。Li等[43]研究發(fā)現(xiàn)，將可溶的萘醌負載在氧化石墨烯上制備成固態(tài)的醌類化合物，能很好地促進微生物的鉻還原能力。因此，與可溶性穿梭體類似，具有合理氧化還原電勢的固態(tài)納米材料也可以作為氧化還原介體介導微生物的電子傳遞。

一般來說，微生物由呼吸作用獲取的能力與納米材料的中點氧化還原電勢具有相關性[27]。理論上，納米材料的氧化還原電勢應介于兩個氧化還原的半反應之間[44]。納米材料的氧化還原電勢不應低于終端電子受體的電勢，否則納米材料無法轉(zhuǎn)移電子；同理，若氧化還原電勢比電子受體高太多，則該反應無法順利進行[44]。Bian 等[45]通過Sn 摻雜In2O3納米線（SINWs）調(diào)節(jié)其氧化還原電勢到所需的范圍，以降低細菌-電極界面的能壘，與未修飾納米線的平面FTO 電極相比，SINW 修飾后可以使電流提高60 倍。微生物外膜的細胞色素氧化還原電勢位于-0.2 V，希瓦氏菌分泌的黃素氧化還原電勢為-0.4 V，合成Sn 摻雜的In2O3納米線的氧化還原電勢位于-0.57 V，在+ 0.2 V 的偏壓下，細胞外膜傳遞的電子可以被黃素的氧化態(tài)接收，而合成的納米線可以接受黃素還原態(tài)的電子并最后轉(zhuǎn)移到電極上。黃素/丙二酸的外源添加只增強/阻礙這一間接電子傳遞過程，也進一步證實了合成的納米線可促進間接電子傳遞過程?；陬愃频牟呗裕渌哂羞m當氧化還原電勢的納米材料，如α-Fe2O3、γ-Fe2O3和Fe3O4可以匹配細菌OMCs的能級并縮小電荷轉(zhuǎn)移間隙，也被開發(fā)為可以有效介導EET 的納米材料[46-47]。O'Loughlin[48]采用多種納米材料介導S. putrefaciensCN32 還原纖鐵礦，研究顯示納米材料在表觀電勢為-254～+11 mV條件下與Fe還原速率具有較好的相關性，其中r2高達0.973。因此，熱力學因素氧化還原電勢不僅決定著納米材料介導EET 的順利進行，還對納米材料介導EET 的速率具有很大影響。表1總結了部分納米材料的氧化還原電勢和電子轉(zhuǎn)移能力。

2.3 納米材料的表面結構與性質(zhì)

納米材料的微納拓撲結構能有效直接影響微生物的黏附、增殖以及分化等生物學行為[52]。比如納米顆粒、納米管、納米線、納米纖維和納米片，不同的形貌會造成電子傳導距離和接觸活性位點面積的不同，因此會影響電子傳遞效率。Xie等[53]使用溶劑誘導平面基底上的碳納米管薄膜先溶脹后收縮，形成三維的褶皺結構，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后形成的拓撲結構會促進細胞和納米材料之間的相互作用從而影響細胞功能。起皺的碳納米管膜利于微生物的附著、生長和電子轉(zhuǎn)移，這種表面結構構建的陽極，使微生物燃料電池的輸出電流提高了2.6倍。三維的孔道結構無論是在化學催化領域還是生物催化領域，都是目前納米材料結構設計的熱點方向，主要是因為這種結構不僅允許微生物的內(nèi)部定殖，還有利于底物和介質(zhì)的暢通運輸，保證了生物膜中細胞的高生存能力和高效的EET[54]。另外，層級有序的三維連通孔道可提供多方向、高通量離子運輸通道，有助于提升表/界面反應動力學。Holder 等[55]采用分凝成冰誘導的自組裝技術制備了3D 殼聚糖/真空剝離石墨烯復合材料并將其用于生物電化學系統(tǒng)。證明了大孔和中微孔的協(xié)同作用，其中相互交聯(lián)的大孔可以提供細菌進入材料內(nèi)部和緩沖離子進而縮短擴散距離，薄壁上的中孔以及由于石墨烯堆垛而形成的微孔提高了接受電子的面積。一些特殊巧妙的結構設計也被開發(fā)用于增強EET，如Wang 等[50]使用電化學聚合法制備出了帶有吸盤結構聚吡咯納米線陣列，當其用于微生物燃料電池的陽極時，陣列上附著的細菌在新陳代謝過程會消耗陣列內(nèi)管的氧氣導致形成真空態(tài)，從而促使電極與細菌的強烈吸力，加快它們的相互作用，進而驅(qū)使微生物基于細胞色素c的直接電子傳遞。這種結構設計的微生物燃料電池功率密度高達728 mW/m2，未來有望通過優(yōu)化陣列的尺寸進一步提高電池性能。

表1 納米材料介導微生物EETTable 1 Nanomaterials mediated microbial extracellular electron transfer

納米材料的表面性質(zhì)（親水性或者疏水性）也會對細胞行為產(chǎn)生影響。Ding等[56]研究發(fā)現(xiàn)納米材料表面的濕潤性極大地影響了Shewanella loihicaPV-4的EET能力，該菌在親水性的電子表面的EET能力比在疏水性表面高5 倍。研究表明，納米材料表面的濕潤性會影響胞外膜細胞色素的氧化還原態(tài)，胞外膜細胞色素為還原態(tài)時更利于外膜細胞色素與黃素結合，使胞內(nèi)傳遞出來的電子能以黃素-細胞色素輔因子的形式進行傳遞，結合作用下EET效率比黃素單獨作用快103～105倍。

2.4 納米材料的生物相容性

使用納米材料與細菌結合，容易對細胞產(chǎn)生毒害作用，限制了微生物的催化效率。納米材料對細胞的毒害有直接物理破壞，或者產(chǎn)生活性氧自由基間接破壞[57]。有研究報道石墨烯是一種具有良好生物相容性的碳基材料，但也有研究發(fā)現(xiàn)石墨烯具有一定的生物毒性，其尺狀的邊緣容易損害細胞膜，從而影響細胞的活性[58]。Li 等[43]將石墨烯與聚乙烯醇混合，通過真空抽濾制成薄膜用于鉻還原，不僅增加生物相容性，而且制膜可循環(huán)利用，利于經(jīng)濟效益。納米材料的生物相容性并不絕對，與其形狀大小、表面電荷、官能團及添加量密切相關[59]。另外，研究也發(fā)現(xiàn)同一納米材料作用于不同種微生物時會呈現(xiàn)出完全迥異的生物毒性。

除了降低納米材料的生物毒性外，還可以開發(fā)具有保護細胞活性的納米材料與結構設計。Ji 等[60]設計合成的MOF（metal-organic framework），能與Morella thermoacetica表面的壁磷酸結合形成薄膜包覆結構，細胞表面的MOF 可以催化降解氧應激產(chǎn)生的活性氧自由基，降低了這種厭氧微生物在有氧條件下的5 倍死亡率。半導體材料如CdS[61]、ZnS[62]、InP[63]等也被廣泛用于微生物系統(tǒng)，它不僅可以利用半導體材料優(yōu)異的光吸收性能，而且通過微生物和半導體的緊密接觸可以降低電子轉(zhuǎn)移的電阻，實現(xiàn)將太陽能高效轉(zhuǎn)化為電能/化學能。光激發(fā)下CdS空穴產(chǎn)生的活性氧物種（·OH、O2-·和H2O2）對細菌會產(chǎn)生一定的毒性并影響其生物活性，進而限制微生物的催化活性。針對這一問題，Chen 等[64]通過簡單快速的方法在CdS 表面修飾Mn3O4納米酶，Mn3O4對CdS產(chǎn)生的活性氧物種有及時分解和物理分離的作用，原位修飾Mn3O4后·OH、O2-·和H2O2的濃度分別減少了90%、77.6%和26%，氮還原提高了28%，N2O 的生成量減少了78%。解決納米材料與微生物作用的生物相容性問題，進而有效地增強微生物的催化活性。

2.5 納米材料-微生物界面構筑

除了考慮納米材料本身的性質(zhì)與結構外，納米材料與微生物相互作用的界面也決定二者間的能量和電荷傳遞[65]?？偨Y以往的納米材料與電活性微生物界面構筑的研究進展來看，從最早期研究者使用納米材料對電子受體（如最常用的電極）進行修飾，電活性菌自然生長在納米材料表面；到后面發(fā)展了一種新策略，納米材料與微生物混合形成雜化的生物膜；為了更充分利用細菌胞外膜上的每一個活性位點，使用納米材料原位修飾在細胞表面；緊接著，為了使納米材料與微生物作用更緊密一步，將微小的納米材料插入到細胞膜或周質(zhì)空間，與細胞膜上的電子鏈的蛋白進一步作用；最后到近期，將超小的納米材料引入到細胞內(nèi)部，拓展了界面構筑的新思路。納米材料介導微生物胞外電子傳遞的過程，通常同時受多種因素影響，對于納米材料的選取、構筑方式，一般都以研究目的或?qū)嶋H應用進行兼容考慮。因此，接下來選取納米材料-微生物界面構筑這個角度，闡述界面構筑對EET 的增強機理以及優(yōu)缺點，為具有類似功能的納米材料提供構筑思路。

3 納米材料-電活性微生物界面構筑及胞外電子傳遞的研究進展

3.1 電子受體表面修飾的電子傳遞

圖2 氧化石墨烯介導S.xiamenensis還原Cr(Ⅵ)的胞外電子傳遞路徑圖(a)[66]；IO-ITO|G.sulfurreducens電極組裝成三電極體系,G.sulfurreducens置于硅片上的原子力顯微鏡圖像,G.sulfurreducens在IO-ITO骨架上形成生物雜化電極的示意圖(b)[69]Fig.2 The pathway diagram of graphene oxide films mediates extracellular electron transfer of S.xiamenensis to reduce Cr(Ⅵ)(a)[66];An IO-ITO|G.sulfurreducens electrode is assembled into a three-electrode system;Atomic force microscopy(AFM)image of G.sulfurreducens on a silicon wafer;Schematic representation of a biohybrid electrode where G.sulfurreducens colonized on the IO-ITO scaffold(b)[69]

自然條件下電活性微生物在固體胞外受體表面形成的生物膜薄且導電性差，為此很多研究團隊開發(fā)了一系列的功能納米材料以改善細菌和胞外受體的相互作用。Li 等[66]使用GO/PVA 復合膜作為外源電子中介體，介導ShewanellaEET用于Cr(Ⅵ)還原體系，使還原效率提高了3.13 倍[圖2(a)]。研究發(fā)現(xiàn)，在還原過程中，GO/PVA 膜不僅作為氧化還原中介體傳遞電子，GO/PVA 膜的添加還會影響細胞的生理變化，提高電子傳遞鏈上的細胞色素c相關基因表達量。分別提高這些相關基因（mtrA、mtrB、mtrC、mtrD、mtrF和omcA）的表達量后發(fā)現(xiàn)，基因表達水平的提升能顯著促進Cr(Ⅵ)的還原速率。Zhao等[67]通過在負載石墨烯的陽極表面修飾一層離子液體，帶負電荷的陽極表面變?yōu)閹д姾伞Ｓ捎陟o電作用，經(jīng)離子液體修飾的電極可以緊密地吸引帶負電的希瓦氏菌，增強且加速了細菌的附著，其輸出的生物電流提高了7倍。雖然電子受體表面修飾對微生物的遠距離傳輸作用甚微，但可以有效縮短電極表面生物膜的形成時間，在實際應用中具有一定的研究價值。Du 等[68]使用聚多巴胺對電極表面進行修飾，聚多巴胺改善了電極表面的親水性，縮短電池的啟動時間，經(jīng)聚多巴胺修飾后形成的生物膜具有長期穩(wěn)定性和耐久性，并且制備簡單可以很好地放大規(guī)模。近年來，考慮到電子受體修飾是通過胞外膜細胞色素c和納米導線的直接電子傳遞來直觀有效地增強EET 性能，諸多研究團隊致力于開發(fā)制備3D 大孔結構，增加電極表面電活性細菌的載量。如Fang 等[69]設計了一種反蛋白石三維結構的錫化銦電極[圖2(b)]，這種電極結構有著相互連接且均勻的大孔隙（8～10 μm），細菌很容易進入到電極內(nèi)部并富集生長，這樣的孔結構利于電極結構內(nèi)部與外界的物質(zhì)傳遞，極大地增強細菌通過胞外膜細胞色素c的直接電子傳遞，產(chǎn)生的電流可達3 mA/cm2。此外，Zou 等[70]通過高溫碳化細菌纖維素制備了3D復合多孔碳納米纖維氣凝膠，通過調(diào)節(jié)碳化溫度巧妙地調(diào)控其納米孔結構（<10 nm）。研究表明，隨著碳化溫度的升高而使得碳纖維氣凝膠中微孔逐漸轉(zhuǎn)換為介孔，通過電子穿梭體傳遞電子的能力增強，介孔不但增加了3D多孔碳纖維電極中電子穿梭體可利用的表面積，并且由于其孔內(nèi)凹凸不平的表面和適當?shù)呐でY構克服了黃素分子（RF、FMN）的空間位阻，從而實現(xiàn)高效的兩電子傳遞。因此，目前修飾電子受體的策略已經(jīng)非常多樣化，是比較容易操作和實現(xiàn)的，且在放大系統(tǒng)中也較穩(wěn)定。

3.2 生物膜雜化的電子傳遞

微生物在自然條件下形成的生物膜，電子受體表面的負載量有限，且不利于生物膜內(nèi)的細菌遠距離傳輸。為了解決這一問題，用導電材料與微生物混合，形成電活性雜化生物膜可以加強電活性微生物遠距離電子傳輸效率。Yong 等[71]通過將氧化石墨烯（GO）添加到MFC 陽極中[圖3(A)]，有效提高S.oneidensisMR-1的EET 效率。研究發(fā)現(xiàn)細菌會將與其緊密接觸的GO 還原為還原型石墨烯（rGO），rGO自組裝成三維大孔網(wǎng)絡結構，大量的細菌黏附在網(wǎng)絡結構中，形成細菌-rGO 導電網(wǎng)絡的雜化生物膜，最終提高了細胞與電極間的雙向電子傳遞，其中氧化電流（電子從細菌轉(zhuǎn)移到陽極）增強了25倍，還原電流（電子從陰極轉(zhuǎn)移到細菌）提高了74 倍。另一項研究報道ShewanellaPV-4 利用溶液中的游離態(tài)離子通過生物礦化作用形成FeS 納米顆粒，混合在微生物之間的FeS納米能介導遠距離細胞外電子轉(zhuǎn)移和連接空間離散的氧化還原環(huán)境[46]。這不僅導致了生物礦化以形成納米顆粒的發(fā)展，而且合成的生物納米顆粒進而提高了微生物的EET 效率。此外，Ma 等[72]研究發(fā)現(xiàn)納米材料還可以促進微生物種間的直接電子傳遞，促使電活性微生物直接通過微生物之間的物理性接觸和納米導線的生成，通過添加TiO2不僅提高了反應體系的導電性，還明顯改變了反應體系中的微生物群落結構，介導并促進互營菌與產(chǎn)甲烷菌間種間直接電子傳遞，從而加速了厭氧產(chǎn)甲烷過程[圖3(B)]?？梢钥闯?，生物膜雜化結構能有效改善微生物的遠距離傳輸，并且在實際體系中具有重要的研究價值。

圖3 (A)三維多孔的還原氧化石墨烯/細菌雜交生物膜的自組裝過程（a）及提出的雙向EET機制（b）[71]；(B)二氧化鈦介導微生物共生產(chǎn)甲烷的原理圖[72]Fig.3 (A)Self-assembly of the 3D microporous rGO/bacteria hybrid biofilm by a fishing process(a),and the proposed mechanism of bidirectional EET(b)[71];(B)Schematic diagram of TiO2-mediated methane production by microbial syntrophism[72]

3.3 細胞表面修飾的電子傳遞

用納米材料制備電活性雜化生物膜雖然可提高微生物的EET 速率，但是由于納米材料不能與生物膜中的所有微生物完全接觸并且與微生物的活性位點存在一定的空間位阻，導致EET 效率降低。因此，用導電材料對單個細菌進行修飾是一種解決方案。如Liu等[39]采用原位聚合的方法，將聚多巴胺（PDA）這種具有醌/半醌結構的氧化還原介質(zhì)[73]修飾在細菌表面，在不影響細胞生存能力的情況下明顯提高了希瓦氏菌的電活性，顯著改善了微生物與電極之間的相互作用[圖4(a)]。其中，在以乳酸為電子供體時，修飾有PDA 的希瓦氏菌的EET 能力得到了明顯提高，其催化的MFCs 的最大輸出功率密度提高了5倍。研究表明，細胞外膜上的c型細胞色素能夠通過細胞表面形成的氧化還原中介體PDA 涂層進行電子傳遞，即使細菌遠離電極，也可以通過PDA 將產(chǎn)生的電子有效地傳遞到電極，從而增強了細胞色素c介導的EET。更重要的是，細菌表面PDA 涂層還可以吸附細菌自分泌的電子穿梭體——黃素增強間接電子傳遞，從而在細胞表面形成了多重傳遞電子路徑。Chen 等[51]報道了一種簡單、高效的提高地桿菌Geobacter sulfurreducens生物發(fā)電能力的方法[圖4(b)]。通過生物礦化作用原位在細菌表面形成Au納米粒子，使得該菌的胞外電子轉(zhuǎn)移能力增強。在生物電化學系統(tǒng)中，表面負載Au的細胞與未負載相比，最大電流密度提升了40%，有機質(zhì)（乙酸）的去除增強了2.2 倍。這些研究表明，用納米材料對單個微生物細胞進行修飾也能顯著加強微生物EET 能力，提高細胞與電極間電子傳遞效率。但由于細胞的分化生長可能會影響系統(tǒng)的穩(wěn)定，因此比較適用于小型化如生物傳感等應用。

圖4 在活細胞表面修飾聚多巴胺以增強細胞外電子傳遞的機制示意圖(a)[39]；原位制備的金納米顆粒增強BES電流的機理圖(b)[51]Fig.4 Proposed mechanism of coating polydopamine(PDA)on individual live cells to enhance extracellular electron transfer(a)[39];Proposed mechanism of a current enhanced of BES with in situ Au-NP fabrication(b)[51]

3.4 跨細胞膜的電子傳遞

有報道稱，適當尺度的金屬和低聚物納米材料可以結合進入細胞的細胞膜，突破EET 的第一道屏障進而加速細胞跨膜的電子傳遞過程。Wu 等[74]通過以脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans為模型生物來研究膜結合生物合成的Pd 納米顆粒對該菌EET過程的影響[圖5(a)]。研究表明了Pd 納米顆?？沙霈F(xiàn)于細胞周質(zhì)空間并代替細胞色素蛋白傳遞電子，其可沿著天然酶介導的EET 途徑來加快電子轉(zhuǎn)移。生物合成的納米材料優(yōu)勢在于它們可以對氧化還原蛋白具有較高的識別能力，并能充分地插入膜中，這是設計合成的納米材料無法輕易實現(xiàn)的。共軛聚合物不僅具有高導電性，并且該分子的π-共軛芳族骨架可以使電荷離域化，而側鏈的離子基團則賦予了其良好的水溶性，這種兩親分子可以與細胞膜發(fā)生物理相互作用或直接穿過細胞膜插入細胞中，從而可以使細胞進行直接EET[75]。Kirchhofer等[76]通過用二茂鐵基的共軛聚合物分子——DSFO+與希瓦氏菌作用，該方法極大地改善了細菌和電極之間的EET，DSFO+首先通過靜電力與希瓦氏菌相互作用，然后通過疏水作用插入細菌細胞壁，從而與細胞色素c緊密接觸，調(diào)節(jié)希瓦氏菌跨膜的電子傳遞過程[圖5(b)]。因此，DSFO+可以直接催化跨膜的呼吸電流，這種策略為加強納米材料和微生物的相互作用更推進一步。然而，目前仍然無法明確低聚物促進微生物EET 過程的具體機制，包括促進細胞膜通透性、細菌附著和加快電子傳遞速率等方面都需要在未來進行研究。

圖5 細胞和電極之間胞外電子傳遞鏈的假設途徑(a)[74]；膜插層共軛氧化還原分子（DSFO+）催化跨膜電子轉(zhuǎn)移(b)[76]Fig.5 Hypothesized pathways for the extracellular electron-transfer chain between the cell and the electrode(a)[74];Membraneintercalating conjugated redox molecule(DSFO+)catalyzes transmembrane electron transfer(b)[76]

3.5 細胞內(nèi)化的電子傳遞

納米材料的細胞內(nèi)在化可引起廣泛的生物反應，也可激活細胞內(nèi)信號通路[77]。由于驅(qū)動EET 通路的生物催化電子池位于細胞質(zhì)內(nèi)，納米材料穿過細胞膜進入細胞質(zhì)可能會產(chǎn)生額外的相互作用，影響電子傳遞、細菌生理和細胞功能。近期，Liu 等[78]通過一步水熱法合成直徑約為7 nm 的碳量子點（CDs），僅通過簡單添加的方式，合成的碳量子點可以被希瓦氏菌內(nèi)化進胞內(nèi)，且具有優(yōu)良的生物相容性（圖6）。在黑暗條件下，內(nèi)化的碳量子點不僅增強了細菌的電導性，而且還刺激了細菌的生理反應使其分泌大量的黃素。另外，在模擬的太陽光照射下，胞內(nèi)的碳量子點受光激發(fā)產(chǎn)生的電子進入到胞內(nèi)代謝中，驅(qū)動了希瓦氏菌的厭氧呼吸進而增強了EET。該研究工作不僅為改善EET性能提供了一種簡便且有效的策略，更為重要的是為探究碳基半導體與微生物的相互作用奠定了基本認識。但關于其生理應激的反應機理和電子轉(zhuǎn)移途徑的闡明目前仍然是一個挑戰(zhàn)。另外，除了單獨的生物電催化，引入其他驅(qū)動力如太陽能來主動驅(qū)動細胞內(nèi)的反應，實現(xiàn)多維能量轉(zhuǎn)換也是一種有效策略。

4 展 望

EET是近年來土壤、生物、能源和環(huán)保等研究領域的熱點，EET 效率的提高是其能否從實驗室走向?qū)嶋H應用的核心。納米材料與電活性微生物的結合能夠有效增強EET 效率。微生物的自身特性、納米材料的性質(zhì)以及微生物細胞與納米材料的結合形式都會對納米材料與微生物的界面相互作用起決定性作用。因此，后續(xù)的研究當致力于以下幾個方面：（1）從電活性微生物本身出發(fā)，在引入納米材料強化的同時，借助分子生物學、生物化學、電化學、物理學等方法進行機理解析，不僅能夠明確與電活性細菌EET 相關的組分及傳遞途徑，還可以為使用基因工程手段進一步強化作指導。（2）從納米材料制備角度來看，用于增強EET 過程的納米材料需要特定的設計來匹配不同的EET 途徑，并解決納米材料自身獨特的理化性質(zhì)與微生物催化更好的結合與兼容性問題，在材料的生物相容性和微生物的化學相容性之間探索出平衡點。另外，新材料的合成也迫切需要開發(fā)，如具有特殊結構的材料、仿生材料和天然材料等。（3）納米材料與細胞膜結合或進入到胞內(nèi)的策略，目前僅包括低聚物和部分金屬/半導體的改性，這表明在材料設計挖掘方面還有很大的發(fā)展空間。另外，納米材料與細胞相互作用的機制也亟待研究。（4）根據(jù)微生物的特性和最終的應用需求選擇合適的材料體系，包括納米材料-電活性微生物界面構筑的策略，可以從這些策略的適用性和局限性進行拓展以及改善。（5）目前的方法主要通過電化學技術觀察納米材料-電活性微生物整體電流或輸出功率來評估復合材料的性能。但是，傳統(tǒng)電化學技術不能揭示EET 的亞種群差異，不能將觀察到的電化學電流與單個修飾材料的細胞聯(lián)系起來，忽略了生物電化學系統(tǒng)活動的潛在復雜空間模式，無法明確區(qū)分在整體電化學性能變化背后的機理。后續(xù)在控制并成像單細胞水平的納米材料-電活性微生物/電極相互作用的工作也會推動對EET的進一步理解。